[发明专利]一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法及其应用

摘要

本发明公开了一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法及其应用，其包括配置脐带间充质干细胞培养基、脐带间充质干细胞的分离制备及富集培养、脐带间充质干细胞生长因子的富集等步骤。本发明富集得到的干细胞生长因子体系的溶液中富含EGF、VEGF、KGF、bFGF、PDGF、TGF‑β干细胞生长因子，成分多样，能够对人体真皮细胞从深层次进行修复再生，上述干细胞生长因子可以刺激真皮细胞修复自身及再生、替换衰老的细胞，一段时间使用后能彻底修复真皮细胞，不易产生依赖性；本发明利用新型的富集方法，时间短，操作简单，避免了干细胞长期正常生长所产生的代谢废物，也去除了培养基，使其生长因子浓度和纯度增加。 1

主权项

1.一种美容护肤干细胞生长因子的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）配置脐带间充质干细胞培养基

MEM培养基加入10%胎牛血清、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子备用；

（2）脐带间充质干细胞的分离制备及富集培养

①手术台取下的脐带，剪短，浸入含抗生素的生理盐水中，放入超净工作台，用含有抗生素的生理盐水冲洗，洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液；

②用灭菌好的手术器械去除脐带表面的外被羊膜及血管，将脐带剪碎成1‑2mm³大小的组织块；

③加入少量配置好的脐带间充质干细胞培养基重悬，转移至75cm²透气盖培养瓶中，轻轻左右摇动培养瓶，使其均匀的铺平瓶底，置于温度为37℃、CO₂浓度为5%的二氧化碳培养箱内培养；

④静止24h，向培养瓶中轻柔的补加脐带间充质干细胞培养基至10ml，注意不要碰到或冲到贴壁的组织块；

⑤3天后，采用1/2换液法换液；

⑥5天后，弃培养基，用不含 Ca^2＋和 Mg^2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液清洗一次，用胰蛋白酶－EDTA消化液消化，并收集细胞，调整细胞浓度，接种于75cm²透气盖培养瓶中；

⑦待细胞融合度达到90%，按照1瓶传4瓶的比例传代于温度为37℃、 CO₂浓度为5%的二氧化碳培养箱内培养；

⑧富集4天后，取其中一瓶计数并用流式细胞计数仪检测CD34^‑、CD44⁺、CD45^‑、CD90⁺、CD29⁺的表达率；

（3）脐带间充质干细胞生长因子的富集

①待脐带间充质干细胞融合度为60‑70%时，加入10nmol/L的Exendin‑4，刺激培养；

②8h后弃培养基，用不含 Ca^2＋和 Mg^2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液清洗两次，去除残余的培养基；

③向清洗完毕的脐带间充质干细胞中加入10ml质量分数为0.9%的生理盐水，将培养瓶置于低氧培养箱中，低氧培养24 h；

④取上清液，于2000r/min离心5 min，取上清，弃去散落细胞及碎片，即可得到富含EGF、VEGF、KGF、bFGF、PDGF、TGF‑β干细胞生长因子体系的溶液。

2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述胰蛋白酶－EDTA消化液是采用2.5g胰蛋白酶和0.2g EDTA溶于1L不含 Ca^2＋和 Mg^2＋离子、PH=7.2的磷酸盐缓冲液而成。

3.如权利要求1‑2任一项所述富集方法得到的干细胞生长因子体系的溶液在制备美容护肤品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将富集得到的干细胞生长因子体系的溶液按照1‑10%不同质量比例加入到不同需求及作用的美容护肤成分中即可。