[发明专利]基于模板材料合成长度固定和特定末端序列DNA文库的方法

摘要

本发明涉及生物领域，具体提供一种基于模板材料合成固定长度和特定末端序列DNA文库的方法，所述方法包括：片段化双链DNA的获取；DNA末端修复与3’端加尾；3’Biotin修饰的A1接头的连接；连接产物的纯化；DNA固定在有链霉亲和素的固相上；双链DNA变性为单链；引物1杂交；使用脱氧核糖基团3’端羟基具有可逆的化学修饰的dNTPs延伸碱基；五碳糖3’端羟基恢复；固定长度的DNA延伸；5’末端修平；末端序列的选择；末端序列的去除；用于分子克隆的接头的连接。本发明方法能够方便地进行无参考基因组、序列变异性高的区域固定长度和特定末端序文库构建，大幅降低了文库构建成本。

主权项

1.一种基于模板材料合成长度固定和特定末端序列DNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括：1)引物杂交：取固定到具有链酶亲和素的固定相上的带有接头A1的单链DNA，将所述单链DNA加入到DNA杂交缓冲溶液和引物1中，梯度退火；所述接头A1为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或为包含CMV、EF1a、SV40、PGK1、Ubc、human beta actin、CAG、TRE、UAS、Ac5、Polyhedrin、CaMKIIa、(Gal1,10)、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35s、Ubi、H1、U6；或T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、Ptac或Pl的序列；所述引物1具有SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。2)碱基延长：然后向步骤1)产物中加入DNA聚合酶和3’端具有可逆化学修饰的dNTPs以延长碱基，之后恢复3’端羟基。3)固定长度DNA延伸：重复步骤2)的循环15～100次，优选为20～30pb，进一步优选20～23次；4)末端修平：加入单链核酸酶除去5’‑末端，其中，所述单链核酸酶为绿豆酸核酸酶、S1核酸酶或CEL I核酸酶；5)末端序列的选择：加入DNA连接酶和接头B1，所述接头B1为包含AscI,Acc65I,AccB1I,ApaI,Asp718I,AspS9I,AvaII,BamHI,BanI,BbeI,Bme18I,BmgT120I,BmiI,BshFI,BshNI,BsnI,Bsp120I,BspLI,BstEII,BstPI,BsuRI,BtsCI,Eco91I,EheI,FseI,HaeIII,KasI,KpnI,PhoI,SanDI,SfoI,SgsI,或SspDI酶切位点的序列；优选接头B1为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或AsiSI,BsePI,BssHII,NotI,HhaI,PauI,或SfaAI序列，以完成末端选择；或替换为在所需选择的序列的位置对应的循环中加入用于延伸的碱基，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，纯化出完整长度的DNA，从而完成末端选择；6)末端序列的去除：加入DNA连接酶和接头B3以除去末端序列，其中所述接头B3为包含Type II S限制性内切酶的序列，优选为包含BbsI、AcuI、AlwI、BaeI、BccI、BceAI、BbvI、BcoDI、BfuAI、BpuEI、BsaXI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BtgZI、EarI、Ecil、FauI、HgaI、HphI、HpyAV、MmeI、MnII、SapI或StaNITypeII S限制性内切酶的序列；更优选接头B3为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；7)克隆接头的连接：加入DNA连接酶和接头B4，以连接接头B4，所述接头B4为具有SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。