[发明专利]一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法

摘要

本发明提供了一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法。使用一定浓度的麦胚清蛋白（WGA）与肝癌细胞共培养24小时，分别收集WGA组（Exo‑WGA）和对照组细胞（Exo‑con）的上清液，使用Exo Quick‑TC试剂盒提取外泌体（exosome）；Western‑Blot方法检测鉴定exosomes标志蛋白CD63（抗体）的表达。通过纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）确定exosome的粒径数量分布。技术路线图见附图1。

主权项

1.一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：使用无外泌体的胎牛血清培养HepG2 细胞，待细胞长到50%～65%时，向其中加入WGA（终浓度0.1 mM～0.5 mM）继续培养24小时；对照组不加WGA；步骤2：24小时后，收集上清液于15 ml无菌离心管中进行离心处理（3000 g，15分钟）；离心结束后小心将上清移至另一15 ml无菌离心管中，同时根据说明书加入相应量的Exo Quick‑TC提取液，使得上清：Exo Quick‑TC=5:1，然后轻轻上下颠倒充分混匀；放入4 ℃冰箱中，静置过夜，时间至少控制在12小时以上；步骤3：将步骤2的混合液进行离心（1500 g，30分钟），小心倒掉上清，注意不能冲掉底部沉淀；再次离心（1500 g，5分钟）；用移液枪尽量吸去上清，所得的最终沉淀即为外泌体；加入160 μl PBS重悬外泌体，并充分混匀；分装后，‑80 ℃保存备用；步骤4：纳米颗粒跟踪分析技术是一种比较新颖的表征纳米颗粒的方法，它可直接并实时观测纳米颗粒；NTA 通过光学显微镜收集纳米颗粒的散射光信号，拍摄一段纳米颗粒在溶液中做布朗运动的影像，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学浓度；步骤5：Western blot 方法检测外泌体的标志物，从‑80 ℃冰箱中取出外泌体，冰上自然解冻；加入相应量的蛋白裂解液（RIPA+ 1 mM PMSF），冰上裂解10 分钟；提取蛋白后，使用 Western blot 方法检测外泌体标志蛋白CD63的表达。