[发明专利]一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法

摘要

一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其具体操作步骤包括顺次执行的机械分离绒毛膜组织、胰酶消化、胶原酶Ⅱ消化、细胞过滤、传代纯化、冻存检测等操作步骤。采用该方案来培养人胎盘绒毛膜间充质干细胞所获得的细胞数量大，而且产量高，稳定不易污染且培养成本低。 1

主权项

1.一种人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

1）使用无菌止血钳剥除胎盘的羊膜层并将胎盘蜕膜部分剪下，然后将处理后的胎盘放入培养皿中用生理盐水冲洗，除去较大的血块；

2）将除下的羊膜层剪成2*2cm²大小，并转移到加入青链霉素的生理盐水培养皿中，将其浸泡2min；用止血钳将蜕膜部分的绒毛膜层进行分离，并将分离后的绒毛膜层转移到装有生理盐水的培养皿中备用；

3）将步骤2）中处理好后的绒毛膜层按4~6g每份分开，分别用有齿镊转移到50ml离心管中，并用剪头组织剪将其剪碎，然后用生理盐水定容至40ml，配平后离心分离，弃上清液，留组织块备用；

4）将步骤3）中处理后的组织块加入新的离心管中用胰酶进行消化处理，消化完成后加入25~30ml生理盐水终止消化，配平后离心分离，弃上清液，留组织块备用；

5）将步骤4）中处理后的组织块加入新的离心管中用胶原酶进行消化处理，消化完成后加入25~30ml生理盐水终止消化，用100μm的细胞滤网过滤，将过滤后的细胞悬液配平后利用离心分离，弃上清液，然后将分离后的离心管底部的细胞用生理盐水吹打均匀，配平后再次进行离心分离，弃上清液；

6）将经过步骤5）处理的离心管先用3ml加有青链霉素的培养基将离心管底部的细胞团吹散，再加入12ml加有青链霉素的培养基吹打均匀，平均分配到3个T75培养瓶中，再往每个培养瓶中加入培养基至9ml，然后在培养箱中进行培养；

7）将培养箱培养48min后内进行换液，即将原代培养的培养基全部吸出，然后加有青链霉素的培养基，在培养箱中继续培养，之后每隔3天进行一次换液循环；

8）待细胞铺满瓶底的70~80%时进行细胞传代，将培养瓶中的培养基上清倒出，加入生理盐水冲洗细胞，然后在每个培养瓶中加入胰酶进行消化处理，待瓶底细胞60~80%变圆脱落后加入15~20ml生理盐水终止消化，用100μm的细胞滤网过滤，无需冲洗培养瓶底部细胞，将过滤后的细胞悬液配平后进行离心分离，弃上清液；

9）将步骤8）中处理后的培养瓶先用3ml无抗生素的培养基吹散离心管底部细胞团，在加入17ml无抗生素培养基吹匀，取2~3滴细胞悬液用细胞计数仪计数，然后按照密度2.0~2.5*10⁶个/T75瓶的细胞量进行细胞种植，添加无抗生素培养基至9ml每瓶后用十字交叉法晃匀，放入培养箱中进行培养；

10）待培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时再次传代，重复步骤8）以及步骤9），使接种密度降低为1.5*10⁶个/T75培养瓶；

11）待培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时再次传代，重复步骤8）以及步骤9），将传代细胞按照2.5*10⁶接种到T175培养瓶中，体积为25ml；

12）待T175培养瓶中细胞铺满瓶底80~90%时进行细胞冻存，将培养瓶中的培养基上清倒出，加入生理盐水冲洗细胞，冲洗完成后在每个培养瓶用胰酶进行消化处理，待瓶底细胞变圆脱落后加入20~30ml生理盐水终止消化，将细胞悬液倒入新的离心管中配平后进行离心分离，弃上清液；

13）取步骤12）处理后的离心管，先用3ml生理盐水吹散离心管底部细胞团，再用17ml生理盐水将细胞彻底吹打均匀，取2~3滴细胞悬液用细胞计数仪计数；

14）将步骤13）中取样后的细胞悬液定容至40ml，配平后离心分离，然后向离心管中细胞先加入2ml培养基吹打均匀，再加入2ml含有20%质量浓度DMSO的冻存培养基吹打均匀，然后均匀分装到3个细胞冻存管中即得成品干细胞。

2.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤3）与所述步骤4）中进行离心分离时，控制离心机转速为2000rpm，离心操作时间为5min。

3.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤4）中用胰酶进行消化处理时，采用质量浓度0.125%的胰酶进行消化处理，且加入的胰酶与组织块体积比为3:1，并利用恒温振荡器在37℃的温度条件下消化15min。

4.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤4）中用胶原酶进行消化处理时，采用2.5mg/mL的胶原酶进行消化处理，且加入的胶原酶与组织块的体积比为4:1，并利用恒温振荡器在37℃的温度条件下消化45min。

5.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤5）、步骤8）、步骤12）、步骤14）中进行离心分离时，控制离心机在300G条件下离心10min，即完成离心分离操作。

6.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤8）中用胰酶进行消化处理时，采用质量浓度0.125%的胰酶进行消化处理，而每个培养瓶中加入的胰酶量为3ml，消化时间为2分钟。

7.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤6）、步骤7）、步骤9）中利用培养箱进行培养时，控制培养箱温度在37℃恒温、CO₂体积浓度为5%以获得最优的培养效果。

8.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤12）中用胰酶进行消化处理时，采用质量浓度0.125%的胰酶进行消化处理，而每个培养瓶中加入的胰酶量为5ml，消化时间为2分钟。

9.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤14）中，往离心管中细胞中加入的培养基和冻存培养基均在4℃的冰箱中进行预冷。

10.根据权利要求1所述的人胎盘绒毛膜干细胞分离培养方法，其特征在于，分装到细胞冻存管中的成品干细胞在进行保存时，需要在封口后存入冻存盒进行程序性降温，最后转移至‑196℃液氮储存罐中储存。