[发明专利]应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法

摘要

应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下工艺步骤：1）种细胞的培养；2）繁殖病毒用细胞的悬浮培养；3）病毒的培养与收获。本发明可以缩短生产周期，降低人员配置，污染几率低，占地面积小，并且得到的病毒滴度高，批间差异小。

主权项

1. 应用鹅胚传代细胞系和生物反应器培养小鹅瘟病毒的方法，其特征在于包括以下工艺步骤 ：（1）生物反应器的选择 ：激流式反应器 AP‑20C 型，体积为 10L ；（2）细胞的选择 ：鹅胚传代细胞系 CGBQ ；（3）病毒毒株的选择 ：选用小鹅瘟病毒 SHM 319 株 ；（4）种细胞的培养 ：利用 T175 方瓶中的细胞生长液繁殖 CGBQ 细胞，按 1:3 ～ 1:5 传代，待细胞长满单层后消化、计数，将细胞悬液接种至转管中，每管接种细胞 3×107 个细胞，置微型反应器中进行培养，反应器温度设置为 37℃，转速设置为 42rpm ；（5）繁殖病毒用细胞的悬浮培养 ：首先准备生物反应器 ：检漏激流袋和灌注袋 ；采用灭菌PBS浸泡微载体过夜 ；校正温度电极、pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌 ；组装生物反应器，注入细胞生产液，循环 24 小时进行系统的无菌检验 ；验证合格后，将步骤（4）中培养好的种子细胞消化、计数，无菌条件下按3～6×109个细胞接种至灌注袋中，在温度37～38℃下，以 40rpm、60rpm、90rpm、120rpm 各循环 30min，使细胞贴壁，然后开始 150rpm 循环 ；培养过程中适时测定糖耗，当残糖量至 2g/L 时，进行补糖或补加培养液 ；（6）所述步骤（4）和步骤（5）细胞生长液含 90% Ham’s F12K、10% 胎牛血清，细胞生长液的 pH 为 7.0 ～ 7.6，DO 为 30% ～ 60%，含糖 4.0g/L ；（7）病毒的培养与收获 ：当细胞培养4～6天，当糖耗达到最大时，将小鹅瘟病毒悬液按0.01 ～ 1.0MOI 的接种量接种于激流灌注式生物反应器中，换用维持液进行培养 ；接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近 0 时，即开始收获病毒 ；收获病毒后，反复冻融灌注袋内细胞，收获全悬病毒液 ；（8）所述步骤（7）中的细胞维持液含 97% Ham’s F12K、3% 胎牛血清，维持液的 pH 为7.4 ～ 7.6，DO 为 30% ～ 50%，含糖 4.0g/L。