[发明专利]一种针对靶基因序列检测的方法

摘要

本发明提供了一种针对靶基因序列检测的方法，包括：（1）基于常规PCR（检测基因有无）或者ARMS‑PCR（检测基因分型）的扩增对靶基因进行放大；（2）利用带生物素标记的内侧单引物对扩增序列进行一轮单引物延伸；（3）利用与第（2）步产物互补的固定于固相表面的探针捕获第（2）步产物；（4）利用抗生物素蛋白结合的显色酶与第（3）步捕获的片段上的生物素结合并在显色反应条件下显色评判靶基因的有无或靶基因的分型。本发明无需对目的片段进行扩增后的纯化分离，也无需昂贵荧光装置对靶基因的扩增与否进行检测，而且第一轮PCR与第二轮单引物延伸相结合，再加上探针捕获，可在保持灵敏度的同时提高对靶序列检测的特异性。

主权项

1.一种针对靶基因序列检测的方法，其特征在于包括如下步骤：当检测病原体核酸时，针对待测病原体基因组特定序列设计一对特异引物，利用此对特异引物对抽提后的样本核酸进行扩增，如样本包含病原体核酸，则可扩增出该病原体特定序列的扩增子；当检测人基因组DNA特定基因的SNP位点时，对该SNP位点设计一条野生型特异性引物、一条突变型特异性引物和一条该基因的通用引物，对抽提的样本核酸进行两次平行扩增，一次使用野生型特异性引物和通用引物对，另一次使用突变型特异性引物和通用引物对，根据SNP纯合杂合情况分成三种：A: 野生型纯合，则只有用野生型特异性引物和通用引物对扩增可得到包含该SNP位点的扩增子；B: 突变型纯合，则只有用突变型特异性引物和通用引物对扩增可得到包含该SNP位点的扩增子；C: 野生型突变型杂合子，则使用野生型特异性引物和通用引物对扩增，及使用突变型特异性引物和通用引物对扩增，均可得到包含该SNP位点的扩增子；对步骤（2）产生的扩增产物，加入在扩增子序列原引物的内侧设计一条特异引物，该引物的5’端标记生物素，在PCR条件下进行单引物扩增，如步骤（2）扩增产物含有靶扩增子，则单引物可以相应扩增出相当数量的带有5’端生物素标记的单链靶片段，当步骤（2）扩增产物不含靶扩增子或有非特异扩增片段时，特异单引物无法扩增出相当数量的单链靶片段；针对步骤（3）的单链靶片段，设计与其部分序列互补的寡核苷酸探针并固定于固相载体上，该探针与单链靶序列的互补区域控制在足以捕获单链靶序列但与步骤（3）使用的单向引物无互补区域，将步骤（3）产物通过覆盖有寡核苷酸探针的固相载体上，如产物中含有相当数量的单链靶片段，则标记有生物素的单链靶片段就会被探针捕获，再使用合适缓冲液洗涤固相载体，则残留的单引物也会被洗涤掉；利用包含有结合抗生物素蛋白的显色酶的缓冲液与步骤（4）之后的固相载体孵育，则生物素与抗生物素蛋白结合从而将显色酶连接到固相载体上，使用缓冲液洗涤固相载体后，加入含有显色底物的液相体系，当确实有相当数量的显色酶连接到固相载体时，可通过颜色的变化直接判读是否有靶序列得到扩增；判读时，如检测病原体核酸，显色则表明样本中有病原体核酸；如检测人基因组DNA特定基因的SNP位点，根据SNP纯合杂合情况分成三种：A: 野生型纯合，则只有用野生型特异性引物和通用引物对扩增最终可显色；B: 突变型纯合，则只有用突变型特异性引物和通用引物对扩增最终可显色；C: 野生型突变型杂合子，则使用野生型特异性引物和通用引物对扩增，及使用突变型特异性引物和通用引物对扩增，均可显色。