[发明专利]体外构建奶牛血乳屏障三维模型的方法

摘要

体外构建奶牛血乳屏障三维模型的方法，包括奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞培养，奶牛静脉内皮细胞培养，免疫荧光鉴定乳腺上皮细胞和内皮细胞，Transwell共培养，联合培养基的配制中以催乳素、胰岛素、表皮生长因子、牛生长激素、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子作为与乳腺上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞生长相关的激素和细胞因子；最后在transwell小室接种上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞，从而成功构建了奶牛血乳屏障模型。本发明能够实时、有效的研究营养物质、药物和有毒物质进入乳腺组织和乳中分子机制，不仅填补了国内外空白，还为研究脂类、维生素、药物和有毒物质等穿过血乳屏障的分子机制提供研究平台。

主权项

1.一种体外构建奶牛血乳屏障三维模型的方法，其特征在于包括以下步骤：1奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞培养无菌切取约2g乳腺组织，置于无菌并含的D‑Hanks’液的50ml三角瓶中，温盒带回实验室；超净工作台中，将乳腺组织置于50ml无菌烧杯中，以含10×双抗的D‑Hanks’液冲洗5次，洗净组织附着的乳汁、血液等杂质；将洗净组织置于10ml无菌烧杯中，以灭菌手术剪刀剪成1mm3的小组织块；将所有小组织块转移至另一无菌三角瓶中，加入20ml消化液，封盖后置于37℃摇床中，200r/min振荡消化4h，至无肉眼可见明显组织块；将三角瓶中的消化液通过灭菌的200目金属网过滤到50ml烧杯中，弃掉未消化组织块，收集小烧杯中消化液；将滤出液等分至2个无菌10ml玻璃离心管中，封口后室温，1 500r/min，离心8min，收集细胞沉淀；分别以8ml含1×双抗的D‑Hanks液洗涤细胞沉淀4次，室温，1 500r/min，离心5min；以总体积5ml，DF‑12完全培养液重悬细胞沉淀，并分别铺于2个25cm2细胞培养瓶中，以DF‑12完全培养液将2离心管中液体补至5.5ml，封口后置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养，并观察细胞生长情况；每隔2d更换一次培养液，至细胞生长密度达80％～90％时，0.05％胰蛋白酶0.02％EDTA溶液1mL消化10s，成纤维细胞对胰酶较敏感，此时消化下来的全是成纤维细；加入5mL完全培养基终止消化后，将培养液吸出接种到培养瓶中进行成纤维细胞培养；在原瓶中加入0.05％胰蛋白酶0.02％EDTA溶液1mL消化3min,加入10mL完全培养基终止消化,吸出5mL培养液接种到新培养瓶中进行乳腺上皮细胞传代培养；2奶牛静脉内皮细胞培养在无菌条件下取奶牛静脉，长度>20cm，挤干净血管内血液，用生理盐水冲洗动脉表面至无血色，动脉脉中灌入0.1％I型胶原酶溶液，使之充盈，37℃水浴中孵育20min，其间轻轻挤压并旋转，以使酶溶液充分接触血管内壁，然后将细胞酶溶液收集于预先装有温培养液三角瓶中；用2倍于消化液的温PBS冲洗血管，并收集于小三角瓶中，将细胞悬液装入10ml离心管，1 000r/min离心10min，弃上清，吹打悬浮，再次离心10min，重悬细胞并接种于铺有明胶的25cm2培养瓶中，置于37℃5％CO2饱和湿度培养箱中培养，24h后更换培养液，以后每隔2d换液1次；当原代细胞融合80％以上后，加入0.05％胰蛋白酶0.02％EDTA溶液1mL消化，倒置显微镜下观察，当细胞皱缩变圆、彼此分离时弃消化液，加入细胞培养液终止消化，收集细胞悬液1 000r/min离心10min，弃上清，制成单细胞悬液；此时可用0.5％台盼蓝染色，计算活细胞百分率，并以血细胞计数板计数；调整细胞浓度，接种于培养瓶中继续培养；待细胞长满，彼此融合成片时依上述方法继续传代培养；3免疫荧光鉴定乳腺上皮细胞和内皮细胞分别将长满上皮细胞和内皮细胞的盖玻片置于2.5％多聚甲醛固定10min；室温下1×PBS漂洗3次，每次5min；10％羊血清37℃封闭30min后，去掉正常血清直接加羊抗牛K18抗体和CD31抗体孵育，4℃过夜，抗体用0.3％TritonX‑100/PBS稀释；室温下1×PBS漂洗3次，每次5min；FITC‑兔抗羊IgG 37℃孵育30min；室温下1×PBS漂洗3次，每次5min；PI复染5min后，室温下1×PBS漂洗3次，每次5min；DABCO封片液封片，激光扫描共聚焦显微镜观察、照像；阴性对照片不加一抗孵育，直接进行下步操作；激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy，LSCM)使用双通道(PMT)检测，激发谱线分别为488nm(激发FITC标记的绿色荧光，染K18、波形蛋白和CD31)和543nm(激发PI标记的红色荧光，染核)；扫描模式为xyz，以0.4μm的Z轴步距逐层扫描，点平均2次，面平均4次，两个通道同时扫描成像，overlay处理后采图保存；激光功率和PMT增益恒定；每张切片选取5个视野观察；所有图像分辨率为1024×1024，存储格式为Tif；4 Transwell共培养(1)1mol/L氢氧化钠和10×磷酸盐缓冲液中和胶原，然后1:1的比例和Matrigel混合制成Matrigel‑胶原凝胶，胶原保持1mg/mL。共培养体系中第三代上皮细胞和成纤维细胞以3:1的比例悬浮在3mLMatrigel‑胶原混合液中(模拟体内的比例300 000:100 000)，接种transwell下室，再将培养第三代的静脉内皮细胞3×104的接种于transwell上室Matrigel‑胶原凝胶表面，让上下室的培养液相互通融，从而建立起内皮细胞、成纤维细胞和乳腺上皮细胞的共培养体系，在联合培养基上培养12天；(2)联合培养基的配制①培养基中添加激素和细胞因子的选择以A(催乳素)、B(胰岛素)、E(表皮生长因子)、F(牛生长激素)、I(血管内皮生长因子)、J(成纤维细胞生长因子)作为与乳腺上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞生长相关的激素和细胞因子，后续实验将添加这6种激素和细胞因子；②培养基中添加激素和细胞因子最佳浓度的选择设计了正交试验L25(56)，以确定上述选择添加的激素和细胞因子的最佳添加浓度；并通过极差分析我们找到了最佳添加浓度组合A4B4C1D4E3F3，即胰岛素0.3ug/ml、催乳素3ug/ml、牛生长激素8ng/ml、血管皮生长因子2.5ug/ml、成纤维细胞生长因子1.5ug/ml、表皮生长因子5ug/ml；③联合培养基成分含10％FBS的DMEM/F12，并在其中添加浓度为8ug/ml的牛生长激素，0.3ug/ml胰岛素，3ug/ml催乳素，血管内皮生长因子2.5ug/ml、成纤维细胞生长因子1.5ug/ml、表皮生长因子(EGF)5ug/ml；5体外构建奶牛血乳屏障模型在transwell小室接种上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞，从而成功构建了奶牛血乳屏障模型。