[发明专利]一种提高甘蓝小孢子植株再生及单倍体加倍的方法

摘要

本发明提供一种提高甘蓝小孢子植株再生及单倍体加倍的方法，其包括：①将当年一次性成苗后的株系进行继代分化培养一次；②收集未一次性成苗的株系，将其愈伤组织放于分化培养基II中进一步诱导分化后继代培养；③进行生根培养基生根；④对株系进行炼苗并进行倍性鉴定；⑤出苗前对出苗进行根部处理和单倍体加倍；⑥对于未加倍成功的单倍体株系，继续进行继代培养并再次出苗；⑦组培室保留的株系在多年多次的继代过程中，也会发生自然加倍，大大提高了群体的自然加倍率，未获得足够种子的株系进一步继代培养。本发明通过对小孢子胚状体一次成苗和二次成苗不同的分化培养基培养，不仅大大提高小孢子胚状体的再生率，同时二次成苗更能提高自然加倍率。 1

主权项

1.一种提高甘蓝小孢子再生及单倍体加倍的方法，其特征在于：其包括以下步骤：

①将当年春天获得的胚状体在B5固体培养基中一次性成苗后的株系，放入瓶中，利用分化培养基I，每20‑25天进行继代分化培养一次；

②收集当年春天获得的胚状体在B5固体培养基中未一次性成苗的株系，将其愈伤组织放于分化培养基II中进一步诱导分化，20‑25天后，将诱导出来的芽苗先置于长苗培养基中继代一次；20‑25天后，当再生植株复壮后，利用分化培养基I，每20‑25天进行继代分化培养一次；

③当年的9月中下旬，根据每个株系的组培苗数量在生根培养基中进行生根：对于苗量小于等于3株的株系需利用分化培养基I进一步进行分化继代培养；苗量在4‑5株的株系，每个株系出苗2‑3株；苗量在6‑10株的株系，每个株系出苗4‑6株；苗量在10株以上的，每个株系出苗8‑12株；

④对株系继续培养15‑20天，当其根系长到1‑2cm时，在出苗前2天打开瓶盖进行炼苗，同时利用流式细胞仪法进行倍性鉴定；

⑤出苗前一天晚上，将所有要出苗的株系组培苗从培养基中取出，流水洗净根部培养基，放回原来的空瓶子内，对于单倍体株系，用剪子将根剪至1‑2cm长，用外植体浸泡液在光照通风条件下，浸根8‑12小时，加倍后株系用蒸馏水浸根，然后移栽于温室或大棚内，冬季定植于阳畦或不加温温室内越冬，翌年再生植株抽薹开花，根据植株形态学及开花情况观察倍性；

⑥对于组培室保留的苗子在后期继代过程中断代的单倍体株系，采取抽薹嫩枝回接的方式加以挽救，继续进行继代培养，并于当年秋季再次出苗；

⑦组培室保留的株系在多年多次的继代过程中，也会发生自然加倍，未获得足够种子的株系进一步继代培养，并于当年秋季再次出苗。

2.根据权利要求1所述的提高甘蓝小孢子再生及单倍体加倍的方法，其特征在于：所述诱导分化培养基I为：MS培养基中添加28g/L蔗糖、8g/L琼脂、1mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤及0.1mg/L的α‑萘乙酸，其pH值为5.8～6.0。

3.根据权利要求1所述的提高甘蓝小孢子再生及单倍体加倍的方法，其特征在于：所述诱导分化培养基II为：MS培养基中添加28g/L蔗糖、8g/L琼脂、2mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤及0.1mg/L的α‑萘乙酸，其pH值为5.8～6.0。

4.根据权利要求1所述的提高甘蓝小孢子再生及单倍体加倍的方法，其特征在于：所述长苗培养基为：MS培养基中添加25g/L蔗糖、8g/L琼脂、0.2mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤及0.1mg/L的α‑萘乙酸，其pH值为5.8～6.0。

5.根据权利要求1所述的提高甘蓝小孢子再生及单倍体加倍的方法，其特征在于：所述生根培养基为：1/2MS培养基中添加20g/L蔗糖、8g/L琼脂和0.1mg/L的α‑萘乙酸及0.1mg/L IBA吲哚丁酸，其pH值为5.8～6.0。

6.根据权利要求1所述的提高甘蓝小孢子再生及单倍体加倍的方法，其特征在于：所述外植体浸泡液为含有浓度为2mg/L秋水仙素和浓度为2％体积比二甲基亚砜的蒸馏水溶液。

7.根据权利要求1所述的提高甘蓝小孢子再生及单倍体加倍的方法，其特征在于：步骤②中如果未诱导出幼苗，则一直利用分化培养基II进行诱导分化，直至诱导出幼苗。