[发明专利]一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法

摘要

本发明公开了一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法。具体步骤如下：(1)制备FPBS重悬的尿液细胞；(2)将APTES加入到培养皿，避光放置、洗涤烘干；(3)将重悬的尿液细胞加入APTES培养皿中培养，再依次用多聚甲醛固定、PBS清洗、以及脱脂牛奶封闭；(4)吸除培养皿中的脱脂牛奶(5)向脱脂牛奶中加入anti‑CK抗体和CD45抗体，混合均匀后加入培养皿中，避光孵育；加入DAPI，常温避光孵育；吸除抗体，再加入PBS扫描；(6)吸除脱脂奶粉后，显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色。本发明方法用于无创检测膀胱癌，具有高敏感性和高特异性。

主权项

1.一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)取100mL尿液离心，以1ml含有1wt％FBS的PBS溶液将沉淀重悬，得到FPBS重悬的尿液细胞；(2)将培养皿清洗后，将2wt％APTES溶液加入到培养皿表面，避光放置1～1.5h，再吸除多余的APTES，纯水清洗若干次后，培养皿置于75～85℃的烘箱中烘干；(3)将步骤(1)的FPBS重悬的尿液细胞加入到步骤(2)中的APTES培养皿中培养，之后吸除多余液体，依次用多聚甲醛固定、PBS清洗、以及脱脂牛奶封闭；(4)吸除步骤(3)的培养皿中的脱脂牛奶后，向培养皿中加入PBST清洗；(5)向1ml 5wt％脱脂牛奶中加入2μL的anti‑CK抗体和3μL的CD45抗体，混合均匀后加入到培养皿中，4℃避光孵育过夜；吸除抗体，用PBST清洗，加入1mL的DAPI，常温避光孵育1小时；吸除抗体，用PBST清洗，再加入1mL的PBS扫描；使用GE Cytell细胞成像系统进行扫描；(6)吸除脱脂奶粉后，在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色；观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI‑，显绿色则CK+，不显绿色则CK‑，显红色则CD45+，不显红色则CD45‑，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45‑且满足形态学特征的为循环肿瘤细胞，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。