[发明专利]一种高产奶牛卵裂球重构胚胎的制备方法

摘要

本发明公开了一种高产奶牛卵裂球重构胚胎的制备方法，属于胚胎学领域。本方法具体如下：1、制备体外成熟奶牛卵母细胞；2、解冻高产奶牛冷冻精子；3、制备32细胞期以上高产奶牛体外受精胚胎；4、采用piezo操作系统构建高产奶牛胚胎卵裂球重构胚胎；5、重构胚胎体外培养。本发明通过使用piezo操作系统制备高产奶牛胚胎卵裂球重构胚胎，取代现有技术中使用激光破膜仪或者斜口针制备重构胚胎的步骤，piezo操作系统将电压效应产生的脉冲经由显微注射针头直接作用于欲注射的细胞表面，大大减少了对胚胎的损伤，提高了重构胚胎的存活率。

主权项

1.一种高产奶牛卵裂球重构胚胎的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、制备体外成熟奶牛卵母细胞：a.将屠宰场采集的奶牛卵巢放入添加双抗的25℃灭菌生理盐水中恒温保存7h内带回实验室，依次用30℃、35℃无菌生理盐水洗涤，分别洗涤2次后置39℃水浴锅中备用，10毫升一次性注射器抽吸法获取卵丘‑卵母细胞复合体(COCs)；b.将捡取的卵丘‑卵母细胞复合体(COCs)用提前2h于39℃水浴锅中预热的含有5％胎牛血清(FBS)的DPBS缓冲液洗涤3次，再用提前2h于39℃培养箱中预热的体外成熟培养液洗涤3次后置于CO2培养箱中进行体外成熟培养，采用五孔板培养，培养浓度：100‑150枚/500μL；培养条件39℃,5％CO2，饱和湿度；培养时间22‑24h；体外成熟培养液配方：TCM‑199(Gibco)+10％FBS+10μL/mL双抗(即100IU/mL)+10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(HMG)+1μg/mL雌二醇(E2)；(2)、解冻高产奶牛冷冻精子：西蒙塔尔牛冷冻精液用BO液上浮法处理，奶牛冷冻精液购买于武汉市奶牛改良站，品种为西蒙塔尔奶牛；精子的处理方法：从液氮罐取细管冻精放入37℃水浴中30～40s快速解冻，用75％酒精消毒后剪开细管，将精子放入含有1mLBO液的离心管中，用移液枪轻轻吹打后，上下颠倒几次，置于二氧化碳培养箱中静置20‑30min，使精子上浮，上浮后将上浮的精子离心处理，1500r/min，5min，用BO’液再次离心处理两次，1500r/min，5min；(3)、制备32细胞期及以上高产奶牛体外受精胚胎：a.步骤(1)b体外成熟后的卵母细胞经2％透明质酸酶消化脱去卵丘细胞后置于体外受精液BO’中平衡30min；b.步骤(2)中处理好的精子加入含有步骤(3)a中卵母细胞的体外受精微滴中，精子的终浓度为3×105个/mL；c.体外受精6h后，用移液器轻轻吹打受精卵，除去浮在受精卵表面的精子，用提前2h于39℃培养箱中预热的体外受精胚胎培养液洗涤三遍后置于培养液中进行培养；培养浓度：50μL的培养滴中培养10‑15个受精卵；24h半量换液，5d后可获得32细胞期或以上胚胎；BO液的配方：6.55mg/mL氯化钠+0.3mg/mL氯化钾+0.249mg/mL氯化钙+0.0497mg/mL氯化镁+0.0869mg/mL磷酸二氢钠+3.104mg/mL碳酸氢钠+2.5mg/mL葡萄糖+0.055mg/mL丙酮酸钠+0.065mg/mL青霉素+0.05mg/mL硫酸链霉素；BO’液的配方：BO液+5mM咖啡因+10mg/mL肝素钠+3mg/mLBSA；(4)、采用piezo操作系统构建高产奶牛胚胎卵裂球重构胚胎：a.取发育至32细胞期以上体外受精胚胎用0.25％链霉蛋白酶消化透明带，获得单个卵裂球，转移至含10％FBS的TCM‑199操作滴中备用；选用内径40μm、外径180μm的固定针从时针9点方向吸卵母细胞，并且使第一极体处在1‑3点方向，选用内径15‑20μm的注射针从3点方向进针采用piezo操作系统，利用其电压效应产生的脉冲经注射针头作用于细胞表面，破透明带和细胞膜，去除含有第一极体在内的遗传物质；piezo去除第一极体参数：破透明带3，破细胞膜1；将去掉第一极体的卵母细胞转移至放置有卵裂球的操作微滴中备用；胚胎重构时，选用内径40μm、外径180μm的固定针从时针9点方向吸卵母细胞，选用内径15‑20μm的注射针吸取其中一个卵裂球采用piezo操作系统破透明带置于已经去除包含有第一极体及遗传物质的卵母细胞透明带下备用；或者a’.选用内径40μm、外径180μm的固定针从时针9点方向吸卵母细胞，并且使第一极体处在1‑3点方向，选用内径15‑20μm的注射针从3点方向进针采用piezo操作系统，利用其电压效应产生的脉冲经注射针头作用于细胞表面，破透明带和细胞膜，去除含有第一极体在内的遗传物质。piezo去除第一极体参数：破透明带3，破细胞膜1；将去掉第一极体的卵母细胞转移至放置有卵裂球的操作微滴中备用；取发育至32细胞期及以上体外受精胚胎转移至含10％FBS的TCM‑199操作滴中备用；胚胎重构时，选用内径40μm、外径180μm的固定针吸取32细胞期及以上体外受精胚胎，选用内径15‑20μm的注射针利用piezo操作系统吸取其中一个卵裂球并将其置于已经去除包含有第一极体及遗传物质的卵母细胞透明带下备用；制备注射针的玻璃管购自于eppdorf公司，由发明人自己制备，注射针的针尖为平直的，针尖至针杆弯曲处的内针管内径均为15‑20微米，长度为6‑10mm，针杆弯曲角度为150度；固定针的针尖为平直的，外径180微米，内径40微米，针杆弯曲角度为150度；(5)、重构胚胎体外培养：a.将制备的重构胚胎在融合液中洗涤3次后移入融合槽；b.利用BTX‑2001融合仪进行细胞融合，融合参数：110V 30μs 2DC；c.融合后的胚胎用胚胎培养液CRlaa洗涤3次置入提前2小时平衡过的CRlaa培养基中培养，培养条件：39℃,5％CO2，饱和湿度，24h半量换液，培养7d观察囊胚发育率；培养液CRlaa配方：114.7mM NaCl、3.1mM KCl、26.2mM NaHCO3、0.4mM丙酮酸钠、5.0mM乳酸半钙、3mg/mL BSA、1.0Mm L‑谷氨酰胺。