[发明专利]基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用

摘要

本发明涉及植物培育技术领域，特别是一种基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法及其应用。本发明是一种可靠，快速的鉴定方法，可以在苗期进行。也可以在人工气候箱中按照白粉病的发病条件，提供准确的发病所需要的温度、湿度、光照等环境条件。通过生物技术方法，快速获得在白粉病接种后，材料中CmROR2基因的表达量。通过表达量分析，来确定种质资源的抗白粉病能力。从而达到快速筛选种质资源的目的。

主权项

1.基于甜瓜CmROR2基因的抗白粉病种质筛选方法，其特征在于包括如下步骤：A、取白粉病菌源孢子接种在待接种甜瓜叶片上，白粉病菌源在目标甜瓜叶片轻轻摩擦进行接种；B、目标甜瓜叶片感染后培养三天待白粉病菌源入侵细胞后进行分子生物学鉴定，提取甜瓜感染叶片和未感染白粉病菌的RNA样品；C、取步骤B中RNA样品1.0‑10.0μL，RNA样品加入反转录混合液中，反转录混合液由PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL、RT Primer Mix 1.0μL、5×PrimeScript Buffer 4.0μL和RNase Free dH2O 4.0μL组成，7℃反应15 min，85℃反应5sec进行酶失活，降温至4℃，制得反转录产物cDNA 模板；D、利用特定引物进行PCR扩增，特定引物P1为 GCATCGGGATATGCACAAGTC、P2为 ATACTCGGTGAGCTATTGATG，冰盒上制备扩增混合液，扩增混合液由5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL、gDNA Eraser 1.0μL和步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL组成，再加入 RNase Free dH2O至总体积10μL，扩增混合液放置于4℃环境下；F、冰上融化abm®EvaGreen qPCR MasterMix‑ROX 10.0μL、步骤D中的扩增混合液 1.6μL、步骤C中反转录产物cDNA 模板1μL和灭菌蒸馏水dH2O7.4 μL，并以每分钟2000转进行离心后使用；加入 96 孔板后， 95℃变性10 min，进行循环变性94℃处理15 sec重复40‑45遍；60℃退火处理1min，使用定量 PCR 仪进行分析测定CmROR2基因的表达量；G、使用 2‑ΔΔCt 法对表达量进行分析，接种病菌前至接种3天后，CmROR2基因的表达量增长200%以上，作为筛选抗性种质的指标用于抗性品种选育。