[发明专利]一种适用于检测人外周血表达CD161分子亚群淋巴细胞的单克隆抗体的制备方法

摘要

一种适用于检测人外周血表达CD161分子亚群淋巴细胞的单克隆抗体的制备方法，它属于一种杂交瘤细胞株及单克隆抗体技术领域，具体步骤包括：稳定分泌CD161单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备；杂交瘤细胞分泌的鼠抗人T淋巴细胞CD161蛋白单克隆抗体的制备纯化和验证；将获得的鼠抗人单克隆抗体进一步制成荧光分子(如APC，FITC，PE)流式直标抗体，用于检测表达CD161分子的T淋巴细胞，结合其它的淋巴细胞检测流式抗体，制作活动性结核和结核潜伏感染流式检测试剂盒。本发明的方法所获得的抗人CD161单克隆抗体效价高、特异性非常好，可直接标记多种示踪物，借助目前先进的检测仪器，如：流式细胞仪、化学发光检测仪、磁性分选仪等进行CD161表达细胞的阳性筛选，对于结核病的防治领域有非常积极的意义。

主权项

1.一种适用于检测人外周血表达CD161分子亚群淋巴细胞的单克隆抗体的制备方法，它包括如下的步骤：A：CD161单克隆抗体的杂交瘤细胞株制备：A－a：利用金斯瑞生物科技有限公司的MonoExpress Gold Antibody Service(mouse))服务，采用人工合成DNA序列及原核表达蛋白的方法制备CD161免疫原蛋白；具体所述的CD161免疫原蛋白纯度达到90％以上，备用；A－b：将上述纯化的CD161免疫原蛋白与弗氏佐剂混合，免疫动物选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠三只，鼠龄在8‑14周，腹部皮下注射，每只每次免疫100μg蛋白；共免疫三次，每两次之间间隔三周；第二次免疫后眼眶静脉从采血100μl，采用酶联免疫吸附试验方法检测抗血清，抗体滴度等于高于1:1000，选择滴度最高的小鼠，备用；A－c：取一只健康的ICR小鼠，颈脱臼处死，体表消毒和四肢固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10ml注射器，12#针头，注射5‑10ml HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，离心，沉淀物加HAT培养液重悬，作为之后融合细胞培养的饲养细胞，备用；A－d：取加强免疫后3天的BALB/c小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清，颈脱臼处死，无菌打开腹腔取出脾脏，制成脾细胞悬液，经静置、离心、冰水浴、离心、稀释、计数和RPMI‑1640培养液洗涤得到小鼠脾细胞悬液，备用；A－e：用RPMI‑1640培养液将具有较高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞从培养容器壁上冲洗下来，经收集、离心、稀释、计数和RPMI‑1640培养液洗涤，备用；A－f：将经上述步骤制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50ml的带盖的离心管中，1000rpm离心10min，上清充分吸净，且混匀；用1ml吸管将预热的PEG4000在45‑60s内缓慢加到上述离心管中，摇匀，立即滴加37℃预热的DMEM培养基，使PEG4000稀释而失去作用；A－g：待融合的细胞培养至第5天，观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清，经有限稀释1:10开始，3倍梯度稀释，共6个梯度，用ELSA方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔进行杂交瘤细胞株亚克隆，单抗表达并保种；B：对上述步骤获得的杂交瘤细胞分泌的鼠抗人T淋巴细胞CD161蛋白单克隆抗体的纯化和验证：根据上清亲和力检测结果，选择5株具有高亲和力的杂交瘤细胞株进行保种，并选取一株细胞株进行小量培养和IgG纯化，具体步骤如下：B－a.抗体生产：用含10％FBS、1％Penicillin‑Streptomycin DMEM培养基，将细胞株扩大培养至20ml，4天后收获培养基上清，离心去掉细胞碎片；B－b.抗体纯化：上清过proteinG纯化柱，然后磷酸盐缓冲液30倍柱体积，再用0.1M的glycine(PH＝2.8)洗脱并收集结合的抗体，透析法除去残留的glycine，A280法检测抗体浓度；B－c.抗体验证：ELISA法检测纯化IgG与CD161抗体的亲和力，在ELISA板上分别包被CD161免疫原蛋白和His标签融合蛋白(1μg/ml，100μl/well)，洗涤封闭后，加入梯度稀释的纯化CD161抗体；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，TMB显色，酶标仪读取OD450值；用Western Blot法检测IgG与CD161抗体的亲和力和特异性。