[发明专利]治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及外泌体的联合制剂、制备方法与给药方法

摘要

本发明公开了一种治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法。包括子宫内膜干细胞以及通过饥饿培养获得子宫内膜干细胞外泌体浓缩液。通过对子宫内膜干细胞饥饿培养的方法，促进其生物活性物质的分泌。以外泌体的形式回收子宫内膜干细胞分泌的生物活性物质，大大提高了回收效率、回收方式更为简便。通过不同孔径的生物膜梯度过滤的方法，收集并浓缩子宫内膜干细胞分泌的外泌体，简化了外泌体回收的流程，提高了外泌体的纯度。

主权项

1.一种治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及外泌体的联合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)人子宫内膜干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2‑P8的人源子宫内膜干细胞，按照3‑5*10⁴/cm²的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5‑15％的胎牛血清的培养体系；(2)接种培养2‑4天后，细胞融合率达到80‑95％，细胞生长状态良好，吸弃全部培养上清，并以医用复方电解质注射液清洗细胞2‑4次，然后加入适量复方电解质溶液，使溶液高度达到2‑3mm，放入二氧化碳培养箱中饥饿培养；(3)饥饿培养18‑30h后，回收全部培养上清，以0.22um孔径滤膜过滤，过滤后的培养上清在3000‑5000g的离心力条件下离心10‑20min，再次回收离心上清；(4)在200000‑500000g的离心力条件下对回收的上清离心30‑60min，离心后轻轻取出离心管，以移液管吸弃上部70％‑90％体积的液体，将下部10％‑30％体积的液体及沉淀混合均匀后作为制备子宫内膜治疗制剂的外泌体溶剂，在2‑8℃条件下保存；(5)人子宫内膜干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2‑P8的人源子宫内膜干细胞，按照3‑5*10⁴/cm²的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5‑15％的胎牛血清的培养体系；(6)接种培养2‑4天后，细胞融合率达到80‑95％，细胞生长状态良好，回收全部细胞，并以复方电解质溶液清洗细胞3‑4次，将最终获得的细胞按照0.5‑2*10⁶/ml的浓度重悬于已经复温至18‑24℃的步骤(4)得到的外泌体溶剂中，制备成联合制剂。