[发明专利]双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法

摘要

本发明公开了一种双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法，该方法包括以下步骤：(1)油菜种子的解剖及切片；(2)油菜种子切片的尼罗红染色及DiO染色；(3)油菜种子双荧光标记切片标本制作；(4)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描；(5)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构。本发明利用双荧光标记，并具体通过对染料的具体种类及具体染色过程、后续激光共聚焦深层扫描所采用的扫描条件等进行改进及进一步优选，与现有技术相比能够有效解决油菜种子细胞或该油菜种子细胞内油滴其三维可视化处理难等问题，并且能够实现油滴和细胞体积的精准测量。

主权项

1.一种利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的三维可视化处理或体积计算的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)油菜种子的解剖及切片选取油菜种子在解剖镜下去除种皮并保留种子胚胎；将剥离的种子胚胎分解为外子叶、内子叶及胚轴；将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5‑2mm厚的切片；(2)油菜种子切片的尼罗红染色及DiO染色将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在尼罗红染色液中染色5‑10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3‑5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在DiO染色液中染色5‑15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3‑5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；或者，将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在DiO染色液中染色5‑15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3‑5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在尼罗红染色液中染色5‑10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3‑5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；(3)油菜种子双荧光标记切片标本制作将所述步骤(2)得到的完成了双荧光染色的种子切片置于载玻片与盖玻片之间，由此制作切片标本；(4)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描将所述步骤(3)得到的所述切片标本放到激光共聚焦显微镜下，然后打开559nm激发通道和488nm激发通道，发射波长分别为570‑670nm和510‑550nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描完成后，将扫描得到的所有图像进行保存；(5)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构使用三维重构软件分别对488nm和559nm光激发通道得到的图像进行逐张信号分割并重构，由于得到所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的三维立体图像，或进一步基于积分原理计算得出所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的体积。