[发明专利]一种Cas9/RNP敲除T细胞PD-1和LAG3基因及制备CAR-T细胞的方法在审
| 申请号： | 201810314100.X | 申请日： | 2018-04-10 |
| 公开（公告）号： | CN108531457A | 公开（公告）日： | 2018-09-14 |
| 发明（设计）人： | 陈相波;雷鸣;田朋飞 | 申请（专利权）人： | 杭州荣泽生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/867 |
| 代理公司： | 上海精晟知识产权代理有限公司 31253 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 311215 浙江省杭州*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种Cas9/RNP制备PD‑1和LAG3双基因敲除CD19 CAR‑T细胞的方法，包括将用于敲除PD‑1和LAG3基因的sgRNA及Cas9蛋白与电转试剂混合，加入CD4+/CD8+细胞中进行电穿孔转化；采用CD19 CAR慢病毒转染CD4+/CD8+阳性细胞；以及筛选并培养扩增转染后的T细胞已获得PD‑1和LAG3双基因敲除CD19CAR‑T细胞。本发明选用Cas9/RNP基因编辑系统提高了转染效率和转基因的表达效率和时间，简化了CAR‑T细胞的制备流程，增加了系统的可行性和负载量。另外，本发明敲除PD‑1和LAG3双基因时避免使用转染试剂，安全性更高。 | ||
| 搜索关键词： | 敲除 双基因 制备 转染 基因 细胞 编辑系统 表达效率 试剂混合 阳性细胞 转染试剂 转染效率 电穿孔 负载量 慢病毒 转基因 电转 扩增 蛋白 筛选 转化 | ||
【主权项】：
1.一种制备PD‑1和LAG3敲除CD19 CAR‑T细胞的方法，包括以下步骤：准备CD4+/CD8+ T细胞；准备与用于敲除PD‑1和LAG3基因的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白；将准备的tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白与电转试剂混合，加入CD4+/CD8+ T细胞中进行电转化；准备CD19嵌合抗原受体慢病毒；将准备的慢病毒用于感染电转化后的CD4+/CD8+ T细胞，antiCD3+CD28抗体激活T细胞扩增培养，通过荧光筛选实验以获得PD‑1和LAG3敲除的CD19 CAR‑T细胞。
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