[发明专利]基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法

摘要

本发明涉及一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法，该方法以春季白花马蔺叶片为外植体，以MS为基本培养基，利用激动素(KT)、2,4二氯苯氧乙酸(2,4‑D)、萘乙酸(NAA)、6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)、吲哆丁酸(IBA)激素调节，建立一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系的方法。该发明一个增殖继代周期为4‑5周，愈伤组织诱导率80％以上，愈伤组织不定芽诱导系数为8‑10倍，繁殖不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，保持原有优良性状，为该品种栽培、应用、生产提供科学、有效的繁殖方法，亦可为鸢尾属植物的工厂化生产繁殖提供参考。

主权项

1.一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法，其特征是：包括以下几个步骤：1)外植体筛选：春季选择马蔺健康植株展叶的叶片，选取叶片中间位置，剪下作为外植体；2)外植体消毒：将叶片置于装有清水的200mL烧杯中，加入2‑3滴洗洁精，烧杯口套上纱网后，采用自来水洗净后，加适量洗洁精在自来水处保持冲洗状态30‑40分钟，用滤纸吸干水分；在烧杯中加入质量百分比浓度10％次氯酸钠溶液，使外植体材料完全浸泡其中，加入2滴吐温20(Tween20)制成消毒液，轻轻摇晃，15‑20分钟后倒掉烧杯中所有消毒液，向烧杯中倒入经过高温高压灭菌的无菌水冲洗外植体材料4次，无菌水使用遵循先少后多原则，清洗至烧杯表面没有泡沫后，倒掉烧杯中无菌水，连带烧杯放置于超净工作台上；3)接种：将消毒好的叶片材料用已消毒滤纸吸干，叶片切成小正方形，尺寸为：0.5cm×0.5cm，将切成小方形的叶片平行置于基本培养基MS上，培养时间15天，培养室内温度为24‑26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2000‑2200Lux，Lux为：照度的国际单位；4)愈伤组织不定芽诱导：筛选步骤3)中MS培养基中叶片无污染、叶片边缘膨大的部分，转接于第一培养基上，所述第一培养基构成为：基本培养基MS附加0.02mg/L萘乙酸(NAA)、2.0mg/L 6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)和1.0 2,4‑二氯苯氧乙酸(2,4‑D)；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH6.0；培养30天，叶片诱导出绿色、致密的愈伤组织，培养45‑50天时，叶片诱导的愈伤组织的芽点处长出许多不定芽，培养室内温度为24‑26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2000‑2200Lux，Lux为：照度的国际单位；5)增殖培养：将愈伤组织诱导的不定芽以2‑3个为一丛分别切下来，转接于第二培养基上，所述培养基构成为：基本培养基MS附加0.02mg/L萘乙酸(NAA)、2.0mg/L 6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)和1.0mg/L激动素(KT)；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH6.0；培养室内适宜温度为24‑26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内保持黑暗12小时，光照强度为2200Lux，不定芽开始萌发侧芽，培养35天，分别切下侧芽接种于第三培养基上，所述第三培养基构成为：基本培养基MS附加0.05mg/L萘乙酸(NAA)和3mg/L 6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH6.0；培养室内温度为24‑26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2200Lux；培养30‑35天，每丛不定芽都萌发出6‑10个小侧芽；在种苗产业化生产中，此步骤重复进行，当不定芽重复增殖培养第5次时，侧芽数量继续增长，但会出现变异芽，要及时切除，保持种苗的遗传性状稳定性；当增殖培养超过4次，要适当降低培养基中6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)和萘乙酸(NAA)浓度，6‑BA浓度调整为1.5mg/L，NAA浓度调整为0.01mg/L，避免玻璃化及芽变异；6)组培苗复壮：将侧芽单独剪切后转接到基本培养基MS中，培养20‑25天长成独立复壮苗，复壮苗最长叶长2cm时即可转入生根培养基中，培养室内24‑26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内保持黑暗12小时，光照强度为2000‑2200Lux；7)根诱导：将复壮苗转接至第四培养基生根培养基中；所述第四培养基构成为：基本培养基MS培养基中大量元素含量减半，所述减半大量元素，由质量百分比浓度，950mg/L的硝酸钾(KNO3)，220mg/L的氯化钙(CaCl2·2H2O)，185mg/L的硫酸镁(MgSO4·7H2O)，825mg/L的硝酸铵(NH4NO3)，85mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)组成；附加1mg/L萘乙酸(NAA)；1mg/L吲哆丁酸(IBA)和活性炭3000mg/L；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH6.0；培养室温度为24‑26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内保持黑暗12小时，光照强度为2000‑2200Lux，培养10天，复壮苗长出乳白色根须；8)出瓶移栽：待步骤7)中无菌苗根长大部分为0.5‑1.0cm时，将培养瓶移置过渡培养间，敞开封口膜1/3，使瓶内与室内环境一致，2天后去掉封口膜后再放置1天；采用20‑22℃的水轻轻洗去组培苗根部附着的培养基，将其移栽到装有新珍珠岩的苗盘中，在温室内一层遮阳网条件下放置7天后撤去遮阳网，30天后，计算成活率，即完成高频再生体系。