[发明专利]一种检测嗜肺军团菌毒力的方法

摘要

本发明提供了一种检测嗜肺军团菌毒力的方法，包括(1)将NF‑κB报告质粒(pNFκB‑luc)和海参荧光素酶报告质粒(pRL‑CMV)转入HEK 293T细胞中。(2)测定军团菌：将嗜肺军团菌浓度调至相同，使用200ul感染转染24小时后的HEK 293T细胞或稳定表达细胞系。(3)肺军团菌感染HEK 293T细胞24h后，用Dual‑Luciferase Reporter Assay System试剂盒及GloMax Multi多功能检测仪检测并记录好各项数值。若NF‑κB活化水平越高则该待测嗜肺军团菌毒力越强；若NF‑κB活化水平越低则该待测嗜肺军团菌毒力越弱。本发明提供的方法能够更加准确的反应军团菌在宿主体内的真实的毒力，具有更大的临床意义和参考价值，并对嗜肺军团菌的预防和控制有积极影响。

主权项

1.一种检测嗜肺军团菌毒力的方法，其特征在于，包括：(1)培养待测嗜肺军团菌菌株；(2)培养HEK293T细胞；(3)完成步骤2，24h后，PEI转染HEK 293T细胞，在200ul无血清的DMEM培养基中加入200ng NF‑κB报告质粒和10ng海参荧光素酶报告质粒混合均匀，然后在混合液中加入2ul PEI工作液混合均匀，室温静置10min；向混合液中加入550ul的2％FBS/DMEM混合均匀，然后吸掉12孔板中细胞培养液，将混合后的转染工作液全量加入，37℃、3h培养后更换正常的细胞培养基；(4)完成步骤3后，刮取BCYE固体培养基中的菌落接种至一定量BYE液体培养基中，37℃，220rpm培养16h；(5)完成步骤4后，设置分光光度计波长，在600nm波长条件下将测定培养军团菌的OD值，并根据OD值将嗜肺军团菌浓度调至相同，并重悬于培养基中；转染培养24h后使用200ul待测嗜肺军团菌感染HEK 293T细胞，感染1h后，用培养基洗细胞后，加培养基培养；(6)完成步骤5，24h后，吸弃24孔板中的培养基，并用PBS洗一遍，用5x PLB裂解液稀释成1X后裂解细胞10min，期间用PBS配制1x LARII和Stop&Glo Reagent反应液，最后用GloMax Multi多功能检测仪检测并记录好分别在萤火虫荧光素酶作用下发光值及海参荧光素酶作用下发光值数值；(7)计算萤火虫荧光素酶作用下发光值与海参荧光素酶作用下发光值数值的相对发光值，进而得到相对发光值与对照组发光值平均值的相对发光增长倍数值。