[发明专利]地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN在杆菌肽生产中的应用有效
| 申请号： | 201810333598.4 | 申请日： | 2018-04-13 |
| 公开（公告）号： | CN108277191B | 公开（公告）日： | 2020-12-29 |
| 发明（设计）人： | 陈守文;蔡冬波;朱江;占杨杨;李俊辉;段茂华;楼丽君;陈晓斌 | 申请（专利权）人： | 绿康生化股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/03;C12P21/00;C12R1/10 |
| 代理公司： | 福州市鼓楼区鼎兴专利代理事务所(普通合伙) 35217 | 代理人： | 李向楠;杨慧娟 |
| 地址： | 353400 福建省*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： |
本发明提供一种通过敲除 |
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| 搜索关键词： | 地衣 芽孢 杆菌 dw2 ccpn 生产 中的 应用 | ||
【主权项】：
1.通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；（2）采用限制性内切酶Xba Ⅰ和Sac I对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；（3）准备质粒 T2(2)‑ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和Sac I对质粒T2(2)‑ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)‑ori；（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)‑ori中，得到ccpN基因敲除质粒T2(2)‑ori‑ ccpN；（5）将ccpN基因敲除质粒T2(2)‑ori‑ ccpN转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ccpN基因的上游臂或ccpN基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；（6）挑选ccpN基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ccpN基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除ccpN基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN；其中，其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ccpN基因为SEQUENCE LISTING中所示。
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