[发明专利]一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫分析方法

摘要

本发明公开一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫分析方法。该传感界面的构筑方法是以碳纳米角、巯基乙胺功能化的金锥以及聚甘氨酸作为基底，并进而固定化玉米赤霉烯酮抗体(Ab)；以酪胺功能化的纳米金红石型TiO₂介观晶体用于固定化特定序列的肽链作为光电探针；由于肽链(peptide)具有模拟玉米赤霉烯酮的作用，玉米赤霉烯酮可与标记的光电探针竞争结合传感界面上固定化的玉米赤霉烯酮抗体。结合到传感界面上的光电探针在辣根过氧化物酶的催化下，能进一步结合酪胺‑金红石型TiO₂介观晶体复合物，进一步放大光电信号。基于该现象可建立起对于玉米赤霉烯酮的无毒光电分析方法。

主权项

1.一种基于肽传感器的玉米赤霉烯酮的无毒光电化学竞争免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）的预处理：GCE首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2）Poly(Gly)/ MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极的制备：滴加3μL浓度为3mg/ml 的碳纳米角(CNHs)悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，将巯基乙胺(MEA)溶液与金锥(Au NCs)溶液反应，得到MEA/Au NCs复合溶液，然后将4μL 的MEA/Au NCs复合溶液滴涂到修饰过的电极表面，在烘箱里烘干冷却至室温；将修饰好的电极浸泡在含有1mM甘氨酸的pH为7.0的PBS缓冲溶液中，在电位窗口为‑0.5~1.8V范围内，以扫速为0.1V/s进行扫描，得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs 修饰电极；最终，将所获得的修饰电极浸泡于1 mg/mL 的玉米赤霉烯酮抗体溶液，在4°C下孵育50 min，随后使用pH7.0的磷酸缓冲溶液去除多余的玉米赤霉烯酮抗体Ab_，再将电极浸入浓度为1.0 wt.%的BSA 1 h，封闭电极表面上非特异性活性位点，冲去表面残余液后，即得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极；（3）Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta‑RMC修饰电极的制备：3 mg/mL的金红石型TiO₂介观晶体（RMC）悬浮液与5mg/mL的酪胺溶液按照1:2的体积比混合吸附30min，离心，用二次水洗涤，去除未吸附的酪胺，将得到的固体用二次水分散，得到RMC‑酪胺复合物(RMC‑ta)溶液；利用酪胺上的羟基与肽链上的羧基反应，将能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide)与RMC‑ta复合物连接，形成标记的肽链peptide@ta‑RMC；将Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab修饰电极浸入不同浓度的玉米赤霉烯酮（ZEN）标准溶液与标记过的能模拟玉米赤霉烯酮的肽链(peptide@ta‑RMC)的混合溶液中于4°C下孵育30min，利用竞争反应结合固定在电极表面的抗体；用pH7.0的磷酸缓冲溶液冲洗电极表面并在室温条件下自然晾干，得到Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta‑RMC修饰电极；（4）玉米赤霉烯酮的检测：采用三电极体系进行测定，以Poly(Gly)/MEA/Au NCs/CNHs/Ab/peptide@ta‑RMC修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，利用光电化学工作站进行检测，设置电压为0.2V，每隔10s进行开关灯，氙灯发射的单色光激发光源使用前由单色仪过滤；在pH 7.0的 PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站进行检测1×10^‑6 ng/mL–1 ng/mL之间的一系列不同浓度的玉米赤霉烯酮标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同电流信号，绘制工作曲线；待测样品溶液代替玉米赤霉烯酮标准溶液进行检测，检测的结果通过工作曲线查得。