[发明专利]一种HIV-1衣壳蛋白抑制剂高通量筛选模型的建立方法

摘要

本发明提供一种HIV‑1衣壳蛋白抑制剂高通量筛选模型的建立方法,该方法包括模型的建立、模型的验证、阴性对照模型建立等步骤，该方法基于均相时间分辨荧光的原理，利用带有GST融合标签的HIV‑1衣壳蛋白C末端CA‑CTD和生物素化的多肽CAI，分别结合带有荧光基团的受体steptavidin‑XL665微珠和供体anti‑GST‑Cryptate微珠，使用荧光激发，当CA‑CTD与CAI相互作用时，发生共振能量转移，诱发受体分子发出荧光，当抑制剂分子阻断CA‑CTD与CAI的相互作用时，荧光将会减弱，因此，通过荧光的强弱可以判断出化合物是否具有抑制CA的作用。

主权项

1.一种HIV‑1衣壳蛋白抑制剂高通量筛选模型的建立方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)模型的建立：反应在在384孔板中进行，反应体系为10ul，将2μl GST‑tagged标记的CA‑CTD、2μl的Bio‑CAI和1μl的缓冲液加入板孔中，室温孵育反应2小时后，每孔中加入2.5μl链霉亲和素标记的Streptavidin‑XL665和2.5μl铕标记的Anti‑GST‑Cryptate，混匀，室温反应1小时，检测665nm和620nm处荧光强度，计算各孔665nm和620nm处荧光强度的比值，得样品荧光比值，确定GST‑tagged标记的CA‑CTD与Bio‑CAI的浓度，即建立了筛选模型；(2)模型的验证：反应在在384孔板中进行，体系为10ul，配置不同浓度的阳性药物CAI，将1ul阳性药物分别与步骤(1)确定浓度的2μl GST‑tagged标记的CA‑CTD和2μl Bio‑CAI一起加入板孔中，室温孵育反应2小时后，每孔中加入2.5μl链霉亲和素标记的Streptavidin‑XL665和2.5μl铕标记的Anti‑GST‑Cryptate，混匀，室温反应1小时，检测665nm和620nm处荧光强度，计算各孔665nm和620nm处荧光强度的比值，得阳性对照荧光比值；(3)阴性对照模型建立：反应在在384孔板中进行，体系为10ul，将步骤(1)确定浓度的2μl GST‑tagged标记的CA‑CTD和2μlBio‑CAI一起加入板孔中，室温孵育反应2小时后，每孔中加入2.5μl链霉亲和素标记的Streptavidin‑XL665和2.5μl铕标记的Anti‑GST‑Cryptate，混匀，室温反应1小时，检测665nm和620nm处荧光强度，计算各孔665nm和620nm处荧光强度的比值，得阴性对照荧光比值；(4)结果：根据以下公式计算各孔的相对抑制率：当抑制剂分子阻断GST‑tagged标记的CA‑CTD和2μl Bio‑CAI的相互作用时，荧光将会减弱。