[发明专利]一种刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼鳃组织的免疫模型构建方法

摘要

本发明首次采用刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼单侧鳃的方式来进行免疫，采用最优化的感染浓度和感染时长，首次构建了刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼鳃组织的免疫模型，彻底消除了鱼类局部鳃组织黏膜免疫应答过程中“先天性差异”所带来的负面影响，为研究局部黏膜免疫应答规律提供了理想的免疫模型。本发明免疫模型的构建方法主要包括5个歩骤：(1)刺激隐核虫活幼虫的收集和浓度计算；(2)斜带石斑鱼的分组和驯养；(3)局部鳃组织免疫；(4)感染强度的测定；(5)局部感染后鱼体的处理。

主权项

1.一种刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼鳃组织的免疫模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)刺激隐核虫活幼虫的收集和浓度计算利用专门的刺激隐核虫传代系统对刺激隐核虫进行传代和收集，其传代宿主为卵形鲳鲹；采集发育良好的刺激隐核虫包囊，置于消过毒的干净烧杯中孵化，孵化用水为高压灭菌的、加入适量青霉素和链霉素的自然海水；收集孵出2小时内的刺激隐核虫幼虫虫液，充分混匀后取50μL，加10μL甲醛将幼虫杀死，在显微镜下计数，计算出幼虫虫液的虫体浓度；(2)斜带石斑鱼的分组和驯养实验用鱼为20g左右的斜带石斑鱼；将斜带石斑鱼分为9组，包括实验组8个、对照组1个，每组15尾鱼；鱼体驯养2周，直至其进食、活动正常；整个养殖过程中，海水经600目的滤网过滤，盐度30‰左右，pH8左右，溶氧量在5.6mg/L以上；(3)局部鳃组织免疫实验组用刚孵出2小时内不同浓度的刺激隐核虫幼虫进行局部感染，实验组设4个幼虫感染浓度：1000、5000、10000、15000个/ml，以及两个感染时间：30s和60s；具体感染过程如下：将斜带石斑鱼置入含1ppm丁香酚的海水中进行麻醉，完全麻醉后取出并用含2ppm聚维酮碘海水冲洗鳃部组织；将鱼体左侧朝下平放于一湿毛巾上面，用手固定鱼体头部并用手指撑开左鳃盖使鳃部组织完全暴露；设置计时器为30s或60s，取一带刻度的一次性胶头滴管吸取总量为1ml的虫液，按下计时器并开始往左侧鳃部组织小心滴入虫液，在15s内滴加完，保持鳃盖张开至计时器响起后，将鱼体两侧鳃盖张开并用无虫水冲洗10s，再将鱼体转移至新鲜海水中正常养殖；对照组用0个幼虫/ml的海水进行感染，感染时间为60s，操作同上；(4)感染强度的测定感染48小时后，各组取5尾鱼进行麻醉，获取左右两侧的所有鳃组织置于盛有海水的培养皿中，于显微镜下计数左右两侧刺激隐核虫的滋养体数量，结果以均值表示；根据测定的各组感染强度结果，获取最合适的感染浓度和感染时间，保证较高的刺激隐核虫感染强度同时对鱼体的存活不造成影响；最合适的感染浓度和感染时间为10000个/ml的虫液感染60s；(5)局部感染后鱼体的处理为避免重复感染，于刺激隐核虫感染后每2天将鱼体转移到干净的养殖缸内，轮换养殖3次后，置于干净养殖缸中正常养殖，获取感染浓度和感染时间为10000个/ml、60s的实验组斜带石斑鱼，即获得刺激隐核虫局部感染斜带石斑鱼鳃组织的免疫模型；移除鱼体后的养殖缸，加入30cm深的淡水，浸泡8小时，即可杀灭所有粘附于缸底的刺激隐核虫包囊，刷洗后排净淡水。