[发明专利]核苷二磷酸激酶NDPK活性的检测方法

摘要

本申请公开了一种核苷二磷酸激酶NDPK活性的检测方法，包括以下步骤：(1)先将不同浓度ADP分别和UTP、荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到混合物；(2)将混合物分成两等份后分别加入测试样品池和对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入NDPK；(4)开启探测仪，检测测试样品池中的产物ADP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度和对照样品池中的荧光强度，得到荧光强度时间曲线；(5)针对不同标准浓度的ATP，测得对应的FATP，进而生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：(7)根据米氏公式，拟合所得的Vmax即是衡量NDPK的活性参数；(8)判断NDPK活性。采用本发明的检测方法能够方便快捷的检测NDPK活性。

主权项

1.一种核苷二磷酸激酶NDPK活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)先将不同浓度二磷酸腺苷ADP分别和三磷酸尿苷UTP、荧光素luciferin/荧光素酶luciferase混合，得到不同浓度的混合物；(2)将其中一个混合物分成体积相同的两等份，一份加入测试样品池，另一份加入对照样品池；(3)在对照样品池中再注入缓冲液，在测试样品池中注入核苷二磷酸激酶NDPK，则测试样品池发生酶促反应：根据上述反应可知：ADP通过上述反应以1:1化学计量生成ATP，终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度；k+表示NDPK同时与ADP和UTP的结合速率；k‑‑表示NDPK与ADP和UTP完全解离的速率；kcat表示NDPK对ADP的催化速率,其中三磷酸尿苷UTP转换成了二磷酸尿苷UDP；(4)开启反应动力学定量探测仪，检测测试样品池中的产物三磷酸腺苷ATP与荧光素/荧光素酶反应产生的荧光强度，旋转测试转盘后检测对照样品池中的荧光强度，在控制器的控制面板中分别显示测试样品池和对照样品池的荧光强度时间曲线；(5)针对多个混合物，不同标准浓度的ATP，测得每个浓度对应的ATP荧光强度FATP(稳态时样品池与对照池的荧光强度差)，进而生成校准曲线；(6)制作米氏曲线：根据所得到的校准曲线，按照以下公式拟合得到比例常数α8：在线性区间:[ATP]＝α8FATP，[ATP]表示ATP的浓度，FATP为[ATP]对应的稳态时样品池的荧光强度减去对照样品池的荧光强度；VATP反应速率是所述荧光强度时间曲线在起始点的导数：t为检测时间，fATP为[ATP]对应的实时荧光强度；基于终态ATP的浓度等同于初态ADP的浓度，不同浓度ADP存在对应的反应速率，以浓度为横坐标，反应速率为纵坐标，在坐标系中标出ADP浓度所述对应的VADP，连接这些点，制作得到米氏曲线；(7)求出Vmax：根据米氏公式：其中，[ADP]表示ADP的浓度，Vmax表示最大速率，KM表示米氏常数；拟合所得的Vmax即是衡量核苷二磷酸激酶NDPK的活性参数。