[发明专利]一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种可同时快速检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的实时荧光RPA引物和探针、包括所述引物和探针的试剂盒及其用途。本发明公开了一种可同时快速检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的方法所述方法使用所述实时荧光RPA引物和探针和试剂盒。本发明的方法的敏感性为10²拷贝/反应，即每个反应可同时最低检测出10²拷贝的猪圆环病毒2型和10²拷贝的猪伪狂犬病毒。本发明的方法能快捷、高效、灵敏的同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒，为两者的混合感染的快速检测提供了有效的技术手段。

主权项

1.引物和探针在制备用于同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的制剂中的用途，所述引物和探针包括：序列如SEQ ID NO.1所示的第一引物，序列如SEQ ID NO.2所示的第二引物，序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针，其中，所述第一引物和所述第二引物组成引物对；序列如SEQ ID NO.4所示的第三引物，序列如SEQ ID NO.5所示的第四引物，序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针，其中，所述第三引物和所述第四引物组成引物对；所述第一探针的修饰如下：(1)第31位碱基修饰BHQ1‑dT；(2)第35位碱基修饰6‑FAM‑dT；(3)第33位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3 Spacer；所述第二探针修饰如下：(1)第27位碱基修饰BHQ1‑dT；(2)第30位碱基修饰6‑HEX‑dT；(3)第28位碱基替换为dSpacer；(4)3'端修饰C3 Spacer；检测的步骤包括：(1)提取待测样本的DNA；(2)以所述DNA为模板，使用所述引物和探针进行双重实时荧光RPA检测：反应过程中实时检测FAM和HEX的荧光信号；对扩增结果进行分析，以扩增起始2.5‑3.5min内的荧光信号强度的平均值加上3‑4倍的标准方差(SD)作为检测阈值，结果判断如下：(a)若在RPA扩增的15min内，FAM荧光信号值超过阈值且出现拐点，而HEX荧光信号未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型阳性，猪伪狂犬病毒阴性；(b)若在RPA扩增的15min内，HEX荧光信号值超过阈值且出现拐点，而FAM荧光信号值未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪伪狂犬病毒阳性，猪圆环病毒2型阴性；(c)若在RPA扩增的15min内，FAM和HEX荧光信号值均超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阳性；(d)若在RPA扩增的15min内，FAM和HEX荧光信号值均未超过阈值或未出现拐点，则表明扩增结果为猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒双阴性。