[发明专利]细胞纤毛内转运蛋白80在上颌快速扩大机械生物信号转导中的调控机制研究方法

摘要

本发明公开了一种细胞纤毛内转运蛋白80在上颌快速扩大机械生物信号转导中的调控机制研究方法，包括以下步骤：a.构建小鼠上颌快速扩大动物模型；b.构建IFT80基因沉默成骨细胞；c.构建体外牵张培养成骨细胞模型；d.构建成骨细胞与破骨细胞共培养模型；e.进行在体转染实验；f.确定IFT80时空表达与上颌快速扩大腭中缝骨改建的关系；g.确定IFT80对体外牵张培养成骨细胞的增殖、分化以及初级纤毛形成和机械生物信号转导的调控机制；h.确定IFT80基因沉默对体外牵张培养的成骨细胞调节破骨细胞功能的影响。上述研究方法对治疗此类错合畸形具有重要指导意义。

主权项

1.细胞纤毛内转运蛋白80在上颌快速扩大机械生物信号转导中的调控机制研究方法，其特征在于，包括以下步骤：a.构建小鼠上颌快速扩大动物模型，小鼠不低于6周龄，确保其第一、第二磨牙均已萌出；b.构建IFT80基因沉默成骨细胞；取胎鼠颅顶骨培养成骨细胞，构建阴性以及针对小鼠IFT80基因的shRNA干扰序列，包装成慢病毒颗粒侵染成骨细胞，筛选出抑制效率最佳的shRNA干扰序列；c.构建体外牵张培养成骨细胞模型，其机械牵张应力参数为：2％形变，0.5Hz；分为静态培养空白组、静态培养阴性序列干扰组、静态培养IFT80基因干扰组、牵张培养空白组、牵张培养阴性序列干扰组和牵张培养IFT80基因干扰组；d.构建成骨细胞与破骨细胞共培养模型：取小鼠股骨骨髓间充质细胞，30ng/ml单核细胞刺激因子(M‑CSF)培养6天，诱导单核细胞分化为破骨前体细胞；随后将破骨前体细胞接种于Transwell小室，成骨细胞接种于Bioflex 6孔加力培养板，构建共培养系统；分为共培养空白组、共培养阴性序列干扰组、共培养IFT80基因干扰组和共培养水合氯醛处理组同时观察静态和牵张培养状态下，各组成骨细胞对破骨细胞功能的影响；e.进行在体转染实验，将获得的包含阴性以及针对小鼠IFT80基因shRNA干扰序列的慢病毒载体在上颌快速扩大腭中缝区域黏骨膜下注射包含针对小鼠IFT80基因shRNA干扰序列的慢病毒载体；隔天注射一次，连续注射3次；f.确定IFT80时空表达与上颌快速扩大腭中缝骨改建的关系；g.确定IFT80对体外牵张培养成骨细胞的增殖、分化以及初级纤毛形成和机械生物信号转导的调控机制；h.确定IFT80基因沉默对体外牵张培养的成骨细胞调节破骨细胞功能的影响。