[发明专利]一种多功能分层关节软骨支架的制备方法

摘要

本发明提出一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，以水凝胶为支架材料，以骨髓间充质干细胞、软骨细胞和成骨细胞为诱导、发育对象，采用3D打印技术来制备模拟天然软骨生物性能和机械性能的多功能分层关节软骨支架。本发明可以精确模拟天然软骨各个分层的内部组织形态和外形轮廓，实现不同的分层具有不同的力学和生物特性。所制备的人工软骨支架细胞来源于患者，支架为可降解水凝胶材料，大大减少了植入之后的排异反应。各种营养物质和生长因子混合在水凝胶支架中，还可以起到缓释的作用，实现对人工软骨生长发育的调控。

主权项

1.一种多功能分层关节软骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：获取待打印软骨组织的三维模型，并分离出软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型；分别对软骨层、钙化层、软骨下骨层的三维模型进行分层切片处理，其中软骨层分为N1层，钙化层分为N2层，软骨下骨层分为N3层，获取分层截面数据；步骤2：培养软骨细胞，获取细胞密度为5×106cells/ml～7×106cells/ml的软骨细胞悬液；培养骨髓间充质干细胞，制备细胞密度为4×106cells/ml～7×106cells/ml的骨髓间充质干细胞悬液；培养成骨细胞，获取细胞密度为3×106cells/ml～6×106cells/ml的成骨细胞悬液；步骤3：制备水凝胶支架基体材料H1组和H2组；基体材料包括去离子水、海藻酸钠、明胶；H1组中海藻酸钠质量分数为2.5％～3.5％，明胶质量分数为0.8％～1.1％；H2组中海藻酸钠质量分数为4.5％～5.5％，明胶质量分数为1.1％～1.5％；并在水凝胶支架基体材料中加入质量分数为0.8％～1.2％的抗生素；步骤4：取H1组水凝胶支架基体材料，加入血管抑制因子，得到软骨层水凝胶支架材料，控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，逐层打印软骨层：步骤4.1：按照软骨层的分层截面数据打印一层软骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤4.2：将步骤2中制备的软骨细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；步骤4.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨层水凝胶支架上；步骤4.4：重复步骤4.1～步骤4.3，直到软骨层打印完毕；步骤5：取H2组水凝胶支架基体材料作为钙化层水凝胶支架材料；采用二氯甲烷与乙醇做溶剂，配置质量分数为3.5％～4.5％的PCL溶液作为静电纺丝材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤4打印完毕的软骨层上逐层打印钙化层；步骤5.1：按照钙化层的分层截面数据打印一层钙化层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤5.2：采用静电纺丝材料在固化后的钙化层水凝胶支架上制备一层纳米纤维层；步骤5.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液打印到纳米纤维层上；步骤5.4：重复步骤5.1～步骤5.3，直到钙化层打印完毕；步骤6：取H1组水凝胶支架基体材料，加入质量分数为2.5％～3.5％的纳米羟基磷灰石，加入血管内皮生长因子A、促进骨生成蛋白生长因子，得到软骨下骨层水凝胶支架材料；控制三维成型设备采用以下过程，按照从软骨层到软骨下骨层方向，在步骤5打印完毕的钙化层上逐层打印软骨下骨层：步骤6.1：按照软骨下骨层的分层截面数据打印一层软骨下骨层水凝胶支架，然后采用质量分数3％～5％的氯化钙进行固化；步骤6.2：将步骤2中制备的成骨细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；步骤6.3：将步骤2中制备的骨髓间充质干细胞悬液按照软骨下骨层的分层截面数据打印到固化后的软骨下骨层水凝胶支架上；步骤6.4：重复步骤6.1～步骤6.3，直到软骨下骨层打印完毕；步骤7：将打印完成的软骨组织放入9.5％～10.5％FBS高糖培养基，移入36.8℃～37.2℃，6.8％～7.2％O2，4.9％～5.1％CO2的细胞培养箱中培养。