[发明专利]一种汉黄芩素抑制SGK1调控非小细胞肺癌细胞命运的方法

摘要

本发明公开了一种汉黄芩素抑制SGK1调控非小细胞肺癌细胞命运的方法，步骤包括：人类非小细胞肺癌细胞培养、细胞传代、细胞活力分析、细胞衰老检测、细胞凋亡检测和细胞周期检测；本发明的有益效果在于，通过不同的汉黄芩素给药方法，能诱导非小细胞肺癌细胞进入细胞周期阻滞、细胞衰老和细胞凋亡的不同细胞状态，因此肿瘤细胞可以从一种命运的转移到另一种命运，以减少盲目使用大剂量化疗药物带来的毒副作用，为临床合理用药提供参考依据。

主权项

1.一种汉黄芩素抑制SGK1调控非小细胞肺癌细胞命运的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：人类非小细胞肺癌细胞培养：将人类非小细胞肺癌细胞培养于加入3ml含10％FBS的RPMI‑1640完全培养基中，RPMI‑1641培养基培养于37℃，CO2体积浓度为5％的培养箱中；步骤2：细胞传代：当细胞生长融合度80％‑90％左右，将细胞培养瓶用酒精擦拭后移入超净台，弃去旧培养液，用PBS缓冲液冲洗涤细胞两遍；加入1ml胰酶消化后，在显微镜下观察细胞形态，当细胞体积缩小变圆、间隙变大时，加入3ml含有10％FBS的RPMI‑1640培养基；步骤3：细胞活力分析：收集对数生长期的细胞，调节细胞密度，每孔加入约5000个细胞，加入96孔板，每孔100μl；当细胞融合度达80‑90％时，加入汉黄芩素的药物终浓度分别为0、5、10、20、40、80μm；汉黄芩素作用12h取出细胞，每孔加入10μl CCK8溶液，培养2h后，用多功能酶标仪在450nm波长测量各孔的吸光度(OD)值；每组设定3个复孔，重复实验3次并取平均值；步骤4：细胞衰老检测：收集对数期生长的细胞，接种于六孔板内，细胞融合度达到80‑90％时开始按不同时间点加入基础培养基溶解的汉黄芩素，样品准备完成，吸除细胞培养液，用PBS洗涤2次，加入1mlβ‑半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟；吸除染色固定液，用PBS洗涤3次，每次3分钟；吸除PBS，每孔加入1ml染色工作液，用封口膜封住6孔板后置于37℃温箱孵育；最后，使用普通光学显微镜观察细胞的衰老状况；步骤5：细胞凋亡检测：细胞培养基吸出至15ml离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入0.5ml胰酶细胞消化细胞；将细胞悬液加入步骤1中收集的细胞培养液1000g离心5min，使用PBS轻轻重悬细胞并且计数；取100000个重悬的细胞，1000g离心5min，弃上清，加入195μl Annexin V‑FITC结合缓冲液轻轻重悬细胞；加入5μl Annexin V‑FITC液体混匀；加入10μl碘化丙啶染色液混匀；室温避光孵育20min，然后置于冰浴中，并使用流式细胞仪检测对细胞进行凋零检测；步骤6：细胞周期检测：收集细胞培养液到一离心管内备用，使用0.5％的胰酶消化细胞，加入细胞培养液并吹打下全部的贴壁细胞；重悬细胞并再次收集至离心管中；1000g左右转速进行3‑5分钟的离心以沉淀细胞；加入约1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml的离心管内；将1ml冰浴预冷的70％乙醇加入细胞中，轻轻吹打均匀，4℃固定约2小时；每一管细胞样品中加入0.5ml的碘化丙啶染色液，37℃温箱避光温浴30分钟；用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况，采用Modifit分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。