[发明专利]一种慢病毒过表达载体介导的E6-AP促进结肠癌细胞生长和转移的实验方法

摘要

本发明公开了一种慢病毒过表达载体介导的E6‑AP促进结肠癌细胞生长和转移的实验方法，检测E6‑AP在不同结肠癌细胞株中表达情况，确定HCT‑116和HCT‑8结肠癌细胞低表达E6‑AP；将含有过表达PCDH‑pCDNA3.0‑FLAG‑E6‑AP质粒与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚肾293FT细胞，获得慢病毒介导的过表达E6‑AP的稳定表达细胞，用实时PCR和Western blot检测E6‑AP的过表达效果；并分别用CCK‑8、划痕愈合和TranswellTM实验检测过表达E6‑AP对结肠癌细胞生长、迁移和侵袭转移的影响。本发明为结肠癌靶向治疗提供一个新的靶标。

主权项

1.一种慢病毒过表达载体介导的E6‑AP促进结肠癌细胞生长和转移的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、Western blot法检测E6AP在不同结肠癌细胞的表达水平：待Lovo、LS174T、HCT‑116、HT‑29、Caco2、HCT‑8、SW480人结肠癌细胞长满后，去除培养皿中DMEM培养基，用1×PBS洗1遍，用胰酶使贴壁细胞消化下来或者直接刮下，收集到EP管中，3000rpm，5min，离心弃上清，在细胞沉淀中加入2～3倍细胞量的蛋白缓冲液于冰上裂解30min，超声破碎后，4℃，12000rpm，10min，离心吸取上清至EP管；马斯亮蓝染色法计算目的蛋白浓度，在目的蛋白中加入等量的2×SDS蛋白上样缓冲液，充分混匀后，煮沸10～15min；取SDS‑PAGE聚丙烯酰胺凝胶平行拔出梳子，固定在SDS‑PAGE电泳槽中，加适量的电泳缓冲液；12 000r/min 2min，将变性好的目的蛋白离心，取上清液上样至凝胶孔中，将电泳仪电压调至成低压状态，样品电泳通过积层胶，电压调至高电，继续电泳至分离胶；待SDS‑PAGE电泳结束后，利用半干转膜仪电转，转膜仪电压调至15V，根据目的蛋白大小适当调节电转时间，使凝胶上目的蛋白转移至硝酸纤维素膜NC上；用1×TBST封闭缓冲液配制10％脱脂奶粉‑TBST封闭液，将电转后的硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭1h或4℃封闭过夜；随后，用10％脱脂奶粉‑TBST封闭液按一定比例稀释小鼠抗人E6AP单克隆抗体、兔抗人GAPDH抗体1:1000，室温摇床上轻摇孵育1～2h或4℃孵育过夜；用1×TBST洗膜，室温下摇床上轻摇5～7min，洗膜3次，洗净未结合的抗体；用10％脱脂奶粉‑TBST封闭液按一定比例稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG 1:3000，室温摇床上轻摇1～2h，TBST洗膜5min×3次，将Western发光检测试剂盒中的两种液体按1:1混合，混合液均匀铺在NC膜上，显色5min，在暗室中压片，曝光时间5～15min，根据不同光强度而调整，最后显影；鉴定出低表达的HCT‑116和HCT‑8结肠癌细胞用于后续实验；步骤2、慢病毒过表达E6AP载体的包装：将贴壁的293FT细胞消化，接种于6孔板中，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基，常规培养，转染前观察细胞密度，待转染时293FT细胞贴壁密度达到60％～70％，包装前1h更换新鲜无双抗DMEM；将Megatyan1.0 8.4μL慢病毒包装转染试剂与200μl无血清无双抗的新鲜DMEM培养基混合，涡旋震荡10s，室温静置5min，期间再将PCDH‑pCDNA3.0‑FLAG‑E6‑AP 1μg与辅助质粒PLP1 0.84μg、PLP2 0.4μg、VSVG 0.56μg加入到200μL无血清无双抗新鲜DMEM培养基混合，涡旋震荡10s，室温静置5min，然后将上述两种溶液混合，涡旋震荡10s，室温放置15min，加入到含有10％胎牛血清的DMEM培养基的293FT细胞中，转染48～72h后在生物安全柜中收取病毒上清，4℃，3000r/min，10min，离心去除细胞碎片，0.22nm滤器过滤病毒上清，感染已接种的靶细胞，感染前细胞密度达到60％～80％；步骤3、过表达E6AP的稳定结肠癌细胞株的获得：低表达E6AP的HCT‑116和HCT‑8细胞接种于6孔板中，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基常规培养，感染前观察细胞密度，细胞贴壁密度达70％～80％为宜；每个6孔板加入2ml含有过表达E6AP慢病毒和相应对照慢病毒上清培养基，6～8h小时后换新鲜DMEM培养基，常规养培24h后，更换含2μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养，3～4天后观察细胞死亡情况，待大部分细胞死亡后，感染病毒的单个细胞分裂繁殖并形成单个集落，将其消化、传代到6cm皿或10cm皿中，继续用含puro的培养基培养，直到获得稳定的混合克隆；步骤4、RNA提取及实时定量PCR：待6cm²培养皿中过表达E6AP的稳定表达HCT‑116和HCT‑8结肠癌细胞和相应对照的HCT‑116和HCT‑8结肠癌细胞长满后，去除培养皿中DMEM培养基，用1×PBS洗1遍后吹去，加入500μL Trizol，用枪轻轻吹打数次，混合均匀，吸入EP管中，室温静置裂解5min，按0.2ml氯仿/ml Trizol加200μL氯仿，上下剧烈振荡15s，室温静置2～3min；4℃，12000r/min，15min离心取上层无色上清至另一新的EP管中，加入400μL异丙醇上下混匀，‑20℃,静置5～10min，4℃，12000r/min，10min离心后弃上清，用1ml 75％乙醇洗一遍，温和振荡离心管，悬浮RNA白色沉淀，4℃，7500r/min，5min离心弃上清；EP管口开向侧面，常温干燥；100μl DEPC水溶解RNA白色沉淀，测A₂₆₀/A₂₈₀值定量RNA浓度；取总RNA 2μg、六寡核苷酸苷酸oligo0.5μg、补H₂O 8.9μL至终体积20μl，混合均匀，70℃解链5分钟，迅速冰浴；加入5μL逆转录缓冲液M‑MLY、2.5μL 10mmol/LdNTP、0.6μL RNA酶抑制剂rRNasin‑inhibitor、1μL逆转录酶M‑ML‑RT至另一新的EP管中，将上述两混合物混匀，42℃逆转录60分钟，95℃5分钟逆转录酶失活，从而得到25μL的cDNA第一链，用1/10TE稀释1:20；取1μL cDNA、Green Mix和0.4μL上下游引物，余下用水补齐至20μl体系；将样品加入至RT‑qPCR的专用PCR管中，设置ABI Prism SDS 7000的PCR反应条件：95℃10min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，40cycles；用RT‑PCR仪分别扩增E6AP和β‑肌动蛋白内参基因，其核苷酸序列如SEQ:ID:NO:1‑SEQ:ID:NO:4所示，对其扩增曲线和熔解曲线进行分析，PCR产物是否特异；收集荧光信号按2^‑ΔΔCt公式计算表达相对量；步骤5、Western blot法验证过表达E6‑AP的稳定细胞株中E6‑AP表达效果及对p53、p27蛋白水平的影响，方法同步骤1；步骤6、细胞生长曲线实验：取对数生长期过表达E6AP的稳定表达HCT‑116和HCT‑8结肠癌细胞和相应对照的HCT‑116和HCT‑8结肠癌细胞，无菌操作下用胰酶消化使贴壁细胞成单细胞悬液，将单细胞悬液梯度稀释，通过细胞计数板进行细胞计数，每孔2000～3000个细胞的密度，接种于96孔板中，每组设3个复孔，分别在24h、48h、72h、96h检测细胞增殖活性，加入CCK‑8后37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱孵育1h，用酶联免疫检测仪测定450nm波长下的吸光度A值，以培养时间为横轴坐标，A值平均值为纵轴坐标绘制细胞增殖曲线；步骤7、划痕愈合实验：将稳定表达对照组和过表达组的HCT‑116和HCT‑8细胞按60～70％密度接种于6孔板中，放置于37℃，5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中常规培养，直到形成细胞单层；待细胞密度汇合度接近95％，用200μL黄色枪头沿直线匀速划过细胞，PBS冲洗掉落的胞，更换5％的低浓度血清的DMEM培养基；在倒置显微镜下观察，挑取宽度一致的划痕在显微镜下拍照并作标记，常规培养24h后，在原标记点拍照记录细胞迁移情况，并绘制半定量分析柱状图；步骤:8、TranswellTM实验取100μl液化的基质胶，铺于小室中，室温下静置15～30min，放入24孔板中，用无血清的DMEM将细胞密度稀释成1～105个/ml；下室孔加入100ml含100％血清浓度的DMEM，培养24h；将下层细胞固定，把小室移到另一个24孔板中，3％多聚甲醛固定细胞30min，用PBS洗1～2次，加500ml 0.5％结晶紫ddH2O进行染色1h，PBS洗涤3遍，移入新的24孔板中，用棉棒擦除上室的基质胶及未迁移的细胞，显微镜下观察并进行拍照计数，并绘制半定量分析柱状图；步骤9、统计学分析采用SPSS13.0统计学软件；用x±S表示E6‑AP、p53、p27表达量及相关定量数据；t检验比较两样本组间均数的差异，P<0.05提示有统计学意义。