[发明专利]一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗

摘要

本发明公开了一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗，病毒接种所用细胞系为EB66细胞系（一株鸭胚胎干细胞衍生细胞株），病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养；并经过1）毒种选育；2）建立毒种种子批；3）制备细胞毒液；4）灭活病毒；5）乳化等步骤完成疫苗的制备。本发明方法具有制备的细胞毒液病毒含量高、生产工艺稳定、智能化控制、可大规模无血清悬浮培养、易操作和成本低等特点，制备的鸭坦布苏病毒灭活疫苗具有安全、副反应低、免疫效力高、批间差异小、检验次数少和成本低等优点，为水禽产业预防鸭坦布苏病毒病发生和流行的理想疫苗。

主权项

1.一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，其特征在于，病毒接种所用细胞系为EB66细胞系，病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养；具体包括如下步骤：1）选育毒株：将鸭坦布苏病毒鸭胚适应株在EB66细胞系中连续传代至病毒适应细胞，经有限稀释克隆法，取病毒含量最高的适应毒株继续经EB66细胞培养并从中筛选出候选病毒株；2）建立毒种种子批：将步骤1）所得候选株病毒接种EB66细胞系，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代，处理细胞培养液，各代次毒种的病毒含量应≥10^6.5 ELD₅₀/1ml；以 F2～F7代作为毒种种子批，其中F2～F5代病毒为基础毒种保存，F6～F7代为生成毒种进行下一步工作；3）制备细胞毒液：在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养EB66细胞，培养条件为温度30～37℃，pH7.2～7.5；当反应器中EB66细胞数量达到400～1000万时，接种步骤2）所得的F6或F7代毒种；作用2h后，加入细胞维持液，30～37℃继续培养；30～120h后，当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量≥10^7.1 ELD₅₀/1ml；4）灭活病毒：取步骤3）所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理，加入细胞毒液体积总量0.1～0.2%的灭活剂，2～37℃振荡灭活16～144h得到灭活病毒；5）乳化：向步骤4）所得细胞毒液加入体积总量4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相与水相的体积比1.5～3:1进行乳化，乳化后即得疫苗成品。