[发明专利]一种利用多重PCR荧光标记技术对四倍体紫花苜蓿进行SSR分析的方法

摘要

本发明涉及利用多重PCR荧光标记技术对四倍体紫花苜蓿进行SSR分析的方法。具体包括9个多重PCR组(共23对SSR引物和1条通用引物)及相应的PCR反应体系与反应程序。采用常规的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，用梯度多功能激光扫描成像仪(Amersham Biosciences，USA)在不同的波长下扫描、记录图像。23对SSR标记在染色体上分布均匀，标记间距离不小于10Mbp；标记基因型易于辨识，平均基因型准确率高于95％。采用以上方案对四倍体紫花苜蓿进行遗传多样性分析、群体结构分析及品种鉴定时，具有时间短、准确性高的优点，极大地提高了试验的效率。

主权项

1.一种利用多重PCR荧光标记技术对四倍体紫花苜蓿进行SSR分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)筛选出23对SSR引物，优化组合成9个PCR组如下：A组：引物对BBI131如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，引物对GBG230如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，引物对E776153如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；B组：引物对DMt1H10如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，引物对CBF156如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，引物对DBI28如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；C组：引物对ABE93如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示，引物对CIC338如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示，引物对AMTIC95如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示；D组：引物对GBF56如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示，引物对CAW306如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示，引物对BBG28如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示；E组：引物对HAW178如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示，引物对AAW365如SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示，引物对HAL82如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示；F组：引物对DAW289如SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示，引物对DBE84如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示，G组：引物对HMt1G03如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示，引物对FAW115如SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示；H组：引物对CBF96如SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示，引物对GAW212如SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示；I组：引物对GBG288如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示，引物对BBG280如SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46所示；2)多重PCR：先在所有引物的前导链的5′端添加如SEQ ID NO：47所示的M13(‑21)通用引物序列，然后在A、C、E组的M13(‑21)引物序列前共价结合荧光标记Cy5，在F、G、H组的M13(‑21)引物序列前共价结合荧光标记Cy3，在B、D、I组的M13(‑21)引物序列前共价结合荧光标记6'‑FAM，形成23对SSR特异性荧光引物对；在一个PCR反应管中加入同属一组的SSR特异性荧光引物对，针对同一个DNA模板构成多个不同的反应体系，并按照同一PCR扩增程序完成多重PCR；3)采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行电泳分离，用梯度多功能激光扫描成像仪在不同的波长下扫描并记录图像进行分析。