[发明专利]核酸酶蛋白Cas9的表达载体、构建方法及其表达纯化在审
| 申请号： | 201810481535.3 | 申请日： | 2018-05-18 |
| 公开（公告）号： | CN110499305A | 公开（公告）日： | 2019-11-26 |
| 发明（设计）人： | 周敏;陈沐;王德孚;卢颖洪;王坤 | 申请（专利权）人： | 南京理工大学 |
| 主分类号： | C12N9/22 | 分类号： | C12N9/22;C12N15/62;C12N15/63 |
| 代理公司： | 32203 南京理工大学专利中心 | 代理人： | 刘海霞<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 210094 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种核酸酶蛋白Cas9的表达载体、构建方法及其表达纯化。所述的核酸酶蛋白Cas9的表达载体以扩增的硫氧还原蛋白‑组氨酸标签‑烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的cDNA替代pET32a中原有的硫氧还原蛋白序列，将密码子优化成易于在宿主中表达的、C端融合NLS核定位信号肽和3×FLAG标签序列的Cas9的基因序列整合到硫氧还原蛋白序列中。本发明利用密码子优化和硫氧还原蛋白融合表达获得大量的核酸酶Cas9蛋白，在仅使用LB培养基的情况下，每克大肠杆菌Tuner(DE3)湿菌最后能获得10mg高纯度的活性Cas9蛋白，实现了低成本下，高保真核酸酶蛋白Cas9的高表达。本发明对宿主要求不高，获得的蛋白可以用于大批量的生物体外组装、体内基因编辑实验。 | ||
| 搜索关键词： | 还原蛋白 硫氧 核酸酶蛋白 宿主 密码子优化 蛋白 表达载体 烟草蚀纹病毒蛋白酶 核定位信号肽 大肠杆菌 组氨酸标签 生物体 基因序列 融合表达 体内基因 低成本 高保真 高表达 高纯度 核酸酶 识别位 构建 扩增 湿菌 整合 组装 融合 替代 | ||
【主权项】：
1.核酸酶蛋白Cas9表达载体，其特征在于，以扩增的硫氧还原蛋白-组氨酸标签-烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的cDNA替代pET32a中原有的硫氧还原蛋白序列，将密码子优化成易于在宿主中表达的、C端融合NLS核定位信号肽和3×FLAG标签序列的Cas9的基因序列整合到硫氧还原蛋白序列中。/n
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