[发明专利]黑芥子酶纯化耦合固定化的方法

摘要

本发明提供了一种黑芥子酶纯化耦合固定化的方法，采用刀豆球蛋白结合黑芥子酶的方法，将刀豆球蛋白负载于基材之上，再将黑芥子酶链接在刀豆球蛋白之上，从而达到特异性的将黑芥子酶固定于基材之上，将黑芥子酶的纯化与固定化结合于一体，大大减少了黑芥子酶的纯化难度，提高了固定化效率，通过刀豆球蛋白吸附黑芥子酶表面的糖基吸附黑芥子酶且不吸附ESP蛋白，从而达到减少腈类物质的生成，增加异硫氰酸脂类化合物产量，使得硫代葡萄糖苷转化生成异硫氰酸脂的转化率大大增加。

主权项

1.一种黑芥子酶纯化耦合固定化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)黑芥子酶的提取：将未经高温处理的十字花科植物的种子、花、茎、叶粉碎或者基因工程菌超声破碎后用纱布过滤，之后离心得到含有黑芥子酶酶活的粗酶液；(2)四氧化三铁纳米球的制备：使用FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O，摩尔比为0.1:1‑10:1，在N2保护下溶解在10‑1000ml 0.1‑5M的氨水中，5‑50℃保温30分钟制备四氧化三铁纳米颗粒，之后离心去除上清，沉淀用水洗3次后备用；(3)包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球的制备：取100mg制备好的四氧化三铁纳米球超声20分钟待用，在40℃的条件下加入10‑1000ml乙醇，1‑100ml氨水，0.1‑10ml TEOS与1‑100ml水，反应1‑100分钟后，加入超声后的四氧化三铁球，机械搅拌1‑50小时后，加入10‑1000ul APTES，反应1‑50h后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用；(4)纳米球表面接枝刀豆球蛋白：按照质量比10:8:1的比例加入80mg EDC与10mg的刀豆球蛋白，在pH为6.0的PBS缓冲液中反应60分钟，之后加入100mg NHS，反应60分钟后加入步骤(3)得到的包裹四氧化三铁的二氧化硅纳米球，保持1小时后离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用；(5)纳米球固定化黑芥子酶：按照刀豆球蛋白与黑芥子酶粗酶液蛋白量1:1‑1:1000的比例对黑芥子酶进行吸附，室温搅拌3小时后使用磁铁吸附或者离心祛除上清，沉淀用水清洗3次后备用；(6)催化得到异硫氰酸脂类化合物并对其纯化：用步骤(5)得到的固定化黑芥子酶粗酶液，调pH至5‑7，温度20‑50℃，水解硫代葡萄糖苷水溶液0‑300分钟，之后离心或者使用磁铁对固定化后的黑芥子酶进行回收，将清液用二氯甲烷或者乙酸乙酯萃取3次，将二氯甲烷相或乙酸乙酯相旋干后进行冷冻干燥处理，得到纯度大于95％的的异硫氰酸脂类产品。