[发明专利]基于N-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法

摘要

本发明属于人体氨基代谢物测量技术领域，具体为基于N‑乙基化衍生方法的多种氨基代谢物同步定量分析方法。本发明步骤包括：氨基代谢物及生物样品的衍生化反应；采用UHPLC‑MS/MS（超高效液相色谱‑质谱联用）对氨基类代谢物的定量检测分析；氨基代谢物的检测与方法学验证；生物样品的普适性验证。本发明采用氨基乙基化的方法，改善了氨基代谢物柱上保留并提高了其质谱离子化效率，使用NaBH3CN/NaBD3CN作为一对稳定同位素标记试剂对分析物进行处理，可实现更为精准的同位素内标定量测量。本发明反应条件温和、操作简便、反应原料易于淬灭、且具有较高检测灵敏度及精密度，适合于多种氨基代谢物同步定量分析。

主权项

1.一种基于N‑乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）氨基代谢物溶液的配制：取80种氨基代谢物，用含有一定甲酸的乙腈水溶液配制成20‑600μM的标准混合溶液；（2）氨基代谢物的衍生化反应：取混合氨基代谢物溶液，用醋酸钠配制成pH为5‑7的反应缓冲液，分别加入NaBH3CN或NaBD3CN（内标），涡旋混匀后加入乙醛水溶液，25‑37℃反应过夜；反应液中，氨基中氢的数目、NaBH3CN及醛的摩尔比大于1:9:18；然后用甲酸调节反应液pH至2‑3，淬灭反应；衍生化反应完成后过滤，得到衍生化产物；（3）生物样本预处理：生物样本为尿液、血清、唾液；对于尿液样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液；对于血清样本，加入甲醇，涡旋混匀，离心，收集上清液；对于唾液样本，离心，收集上清液；取上清液，加入甲醇，涡旋混匀，再次离心，并收集此次上清液；（4）生物样本的衍生化反应：取预处理后的生物样本，用醋酸钠配制成pH为5‑7的反应缓冲液稀释，加入NaBH3CN，涡旋混匀，加入乙醛水溶液，25‑37℃反应过夜，然后用甲酸调节反应液pH至2‑3，淬灭反应；反应液经滤膜过滤，与稀释20‑100倍后的重标标准品按一固定的体积比混合；（5）氨基代谢物标准品的检测：将上述反应后的溶液直接进入UHPLC‑MS进行测定；（6）方法验证：建立80种氨基代谢物的标准曲线，并求得线性范围、R2、LOQ、LOD以及日间差和日内差，以对所建方法的检测灵敏度及精密度进行评估；（7）普适性验证：反应后的生物样本过滤后进入UHPLC‑MS（超高效液相色谱‑质谱联用）进行测定。