[发明专利]高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法

摘要

本发明高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法属于小麦作为食品引起乳糜泻过敏的致敏蛋白的DNA鉴定技术。用导致乳糜泻的小麦谷蛋白和醇溶蛋白DNA序列设计出第三组引物，将待测小麦面粉提取基因组DNA，并用这三组引物进行PCR扩增小麦致敏原扩增DNA产物；把扩增DNA产物用高通量测序仪进行测序，获得谷蛋白醇和溶蛋白基因DNA片段序列；用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将该两种致敏蛋白的DNA片段序列分别与已知的多种蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段比较，得到敏原的DNA片段的个数和位置。优点：能一次性在小麦样品中，定量检测出多种小麦致敏原蛋白肽的DNA短片的数量和位置，所以本方法能作为小麦导致乳糜泻强弱的评价方法的检测技术手段。

主权项

1.高通量测序技术鉴定小麦面粉中乳糜泻致敏原的方法，用谷蛋白基因DNA序列设计出第一组引物和第二组引物，用醇溶蛋白DNA序列设计出第三组引物；并合成第一组引物、第二组引物和第三组引物；将待测小麦面粉提取基因组DNA，用上述的三组引物和小麦面粉提取的基因组DNA在同一个反应体系中进行PCR扩增DNA，获得含有小麦致敏原谷蛋白基因DNA片段和醇溶蛋白DNA片段的小麦致敏原扩增DNA产物；把上述获的小麦致敏原扩增DNA产物用高通量测序仪进行测序，测出用引物所扩增的谷蛋白基因DNA片段序列，和测出这引物所扩增的醇溶蛋白DNA片段序列；用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段序列分别与上述测序得到的谷蛋白基因DNA片段序列进行多次比对，找出谷蛋白基因DNA片段序列中这多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和位置；用两种DNA序列中有相同区段的比对算法，将多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段序列分别与上述测序得到的醇溶蛋白DNA片段序列进行多次比对，找出醇溶蛋白DNA片段序列中这多种已知的蛋白短肽乳糜泻致敏原的DNA片段的个数和位置；上述方法中使用的三种引物是：第一组引物：PF2：5′‑TACACCCACAACACCGAGCA‑3′PF1：5′‑GTAGCTAAGCGGC/TTA/GGTCTTTG‑3′PR1：5′‑CTATCACTGGCTG/AGCCGACAATGCG‑3′第二组引物：LMWi‑F：5′‑CGCTTTCTTGTTTACGGCTG‑3′LMWi‑R：5′‑GATCATTGACATCCACACAAT‑3′LMWs‑F：5′‑CCAACTAGTTAACACTARTCCACC‑3′LMWs‑R：5′‑TTTCAACTAGTTTGGGCGGGTC‑3′LMWm‑F：5′‑TGAAAGACCTTCCTCGTCTTTGC‑3LMWm‑R：5′‑ACTGTAGGCACCAACTCCGGTGC‑3′第三组引物：QP‑alphaF：5′‑CTGCAATACAAATCCAYCATG‑3′QP‑alphaR：5′‑ATTCCTTCTCAGTTRGTACCR‑3′Omega‑F2：5′‑AAGATGACCTTCCTCATCTTTG‑3′Omega‑R2：5′‑ACATTGGCCACCGATGCTTGT‑3′gamma‑F1：5′‑AATTTAGTTAACGCAAATCCACC/TATG‑3′gamma‑R1：5′‑GTGAAATCAGCTAAGCAACGATG‑3′gamma‑F2：5′‑TTCCACACAACTAGAGCACAAG‑3′gamma‑R2：5′‑AGTCTACATCTATTGGTGCATCAG‑3′。