[发明专利]一种毛竹遗传转化的方法

摘要

本发明公开了一种毛竹Phyllostachys edulis遗传转化的方法，它是通过将毛竹愈伤组织适度酶解，然后用质粒DNA转化酶解后的愈伤组织，继而对转化后的愈伤组织进行恢复培养和筛选，从而实现遗传转化的方法。本发明解决了毛竹愈伤组织转化困难、原生质体转化后不易再生等难题，为毛竹的种质创新和功能基因研究提供了新途径。

主权项

1.一种毛竹Phyllostachys edulis遗传转化的方法，其特征包括：愈伤组织酶解、聚乙二醇介导质粒DNA转化、恢复培养和抗性筛选，具体步骤如下：（1）愈伤组织酶解：选择处于旺盛增殖状态的毛竹胚性愈伤组织为材料，分切成直径约0.6‑0.9 cm的小块，取2‑5 g投入装有50 ml酶解液的容积为100 ml的培养瓶中，置于摇床上黑暗条件下振荡酶解2‑4 h，摇床转速40‑80 rpm；倒掉酶解液，加入20‑30 ml W5溶液，略微浸没愈伤组织；酶解液含1%‑3% 纤维素酶，1%‑2%果胶酶，0.1% MES，0.6 M 甘露醇，0.1% 二水氯化钙，1% 牛血清蛋白，将pH值调整为5.6‑5.8；W5溶液含154 mM氯化钠，125 mM 氯化钙；5 mM 氯化钾，2 mM MES，5 mM葡萄糖；酶解液和W5溶液现配现用；（2）聚乙二醇介导质粒DNA转化：将含有W5 溶液和愈伤组织的培养瓶置于冰上静置30 min；加入1‑2 ml浓度为1.0 μg/μl的含有外源基因的质粒DNA溶液，轻柔混匀，置于冰上静置10 min；加入20‑30 ml 聚乙二醇溶液，轻柔混匀，室温静置20 min；加入50 ml的W5 溶液，轻柔混匀，然后倒掉瓶中的溶液；用50‑60 ml 恢复液轻柔冲洗2‑3次，弃溶液；聚乙二醇溶液含0.8 M甘露醇、1.0 M氯化钙和40%聚乙二醇4000；恢复液是以MS培养基为基础，添加0.6 M 甘露醇，20 g/L 蔗糖，10 g/L 葡萄糖，3.0 mM MES，将pH值调整到5.6‑5.8；（3）恢复培养和抗性筛选：在愈伤组织中加入30 ml 恢复液，培养3‑7 d，期间每隔8‑10 h轻微晃动一次；倒掉恢复液，沥出愈伤组织并转入液体浅层‑固定平板双层培养基上培养2周；转入固体平板培养基上继续培养，每2周转接一次，培养1个月取愈伤组织进行检测；液体和固定培养基均以MS培养基为基础，添加30 g/L蔗糖、0.5 mg/L IBA、0.5 mg/L TDZ、抗性筛选剂，唯固体培养基另添加8 g/L琼脂糖；上述愈伤组织酶解、转化、恢复培养和抗性筛选均需在无菌条件下进行。