[发明专利]由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法

摘要

本发明提供了一种由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，该方法主要包括以下步骤：(1)将植物双元载体改造成含有prtA表达盒的双元表达载体，含有GPDA启动子和GPF报告基因；(2)双元载体转化农杆菌AGL1；(3)在DPY培养基培养野生型米曲霉3.042，3天后洗下孢子；(4)孢子与含有目的载体的农杆菌共培养48小时；(5)共培养后的孢子转移到含有头孢和吡啶硫胺素的CD培养基筛选；(6)筛选培养基生长出来的转化子进一步验证。本发明首次建立了农杆菌介导的以吡啶硫胺素为筛选标记的转基因体系，较原来的原生质体介导的转基因体系减少工作量，提高了转化效率，为米曲霉遗传操作奠定了基础。

主权项

1.由农杆菌介导以吡啶硫胺素为筛选标记的米曲霉转基因体系构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)以pPTRⅠ载体为模板，以序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2的DNA片段为引物执行PCR扩增，得到ptrA表达盒；通过酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ将pEX1载体双酶切，将酶切产物与所述ptrA表达盒连接，得到pEX1‑ptrA载体；将所述pEX1‑ptrA载体转化至感受态的农杆菌AGL1株；2)将米曲霉3.042株的孢子接种于PDA或者DPY培养基培养3天，收集孢子；将收集物过滤后以4000rpm的转速离心10min，再用蒸馏水洗涤2次，得到孢子与水的混合物，调整其中孢子浓度至106个/mL，即得到孢子悬液；3)将步骤1)转化后的农杆菌AGL1株接种至10mL同时具有卡那霉素抗性和利福平抗性的LB培养基中，以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养；取1mL该培养液与9mL IM液体培养基混合，而后以28℃的温度、200rpm的转速摇瓶培养6h，得到菌液；4)取100μL步骤3)所得菌液和100μL步骤2)所得孢子悬液，共涂布到铺有玻璃纸的IM固体培养基上，于22℃、避光培养48h；5)将玻璃纸取出，覆盖到同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，30℃培养5～7d；挑取长出的菌落，接种至另一新鲜的、同时含有300μg/mL头孢噻肟和1μg/L吡啶硫胺素的CD培养基上，培养，长出的菌落即为阳性转化子。