[发明专利]一种免疫细胞的分离方法及其应用

摘要

本发明具体公开了一种免疫细胞分离方法，包括以下步骤：S1.在25℃环境中，外周血样本和培养基按2‑4:1比例稀释，并缓慢充分混匀，得到培养基和外周血混合的血液稀释液；S2.以上步骤的血液稀释液和淋巴细胞分离液按1:2‑6比例稀释，混合液加入离心管中，确保混合液形成明显分层，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液以及其他离心计数步骤。本发明釆集外周全血分离免疫细胞，(1)避免大量釆集白细胞，可能会造成的大规模污染和细胞浪费；(2)操作简单可行；避免了患者反复抽血；(3)保证每次治疗用细胞都是新鲜分离的，避免了冻存对细胞的损伤。

主权项

1.一种免疫细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.在25℃环境中，外周血样本和培养基按2‑4:1比例稀释，并缓慢充分混匀，得到培养基和外周血混合的血液稀释液；S2.以上步骤的血液稀释液和淋巴细胞分离液按1:2‑6比例稀释，混合液加入离心管中，确保混合液形成明显分层，上层为血液稀释液，下层为淋巴细胞分离液；S3.4℃低温离心，第1‑10min，1000rpm，上下加速度均为0；第11‑30min，2000rpm，上下加速度均为0；S4.离心结束后，离心管中液体明显分层，从上到下依次为血浆与培养基混合液层、单个核细胞白膜层、人淋巴细胞分离液层及红细胞层，用移液器小心吸取白膜层置于新的离心管，尽量不要吸到其他层，补充培养基，并用移液器轻轻混匀；S5.4℃低温离心，第1‑15min，1000rpm，上下加速度均为9；第16‑30min，1500rpm，上下加速度均为9；S6.去除上清液，保留细胞沉淀，补充等量培养基，并用移液器轻轻混匀，离心洗涤细胞，4℃低温离心，800rpm，1min，上下加速度均为9；S7.重复步骤S6两次；S8.去除上清液，补充等量的培养基，轻轻充分打匀后，用精确10ul量程的移液器吸取10ul细胞悬液，置于一250ul的离心管，随之在管中加入台盘蓝10ul，用移液器充分混勻，台盼蓝染色5min，取10ul细胞悬液均速冲池入血细胞计数板，倒置相差显微镜10倍目镜下计数；分别计数四大格未染成蓝色的细胞总数和染成蓝色的细胞总数。