[发明专利]一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法

摘要

一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，它涉及活化富血小板凝胶制备技术领域。本发明是要解决目前液体PRP及传统凝胶中因子降解快、作用时间短的问题。本发明利用枸橼酸钠抗凝剂的采血耗材根据患者的损伤面积进行采集特定体积的外周血，采用特定富血小板血浆分离技术分离出高血小板含量的血浆；收集捐赠的新鲜、健康皮肤组织进行原代皮肤间充质干细胞培养，收集第4、5代细胞进行冻存备用；分泌型富血小板凝胶包含富血小板血浆、皮肤间充质干细胞、医用CaCl2溶液及含硫酸庆大霉素的乏血小板血浆，经富血小板血浆与皮肤间充质干细胞混合后，平铺于无菌瓶皿中，利用Ca2+对枸橼酸钠抗凝剂的抑制作用进行凝胶制备。

主权项

1.一种用于慢性皮肤损伤治疗的分泌型富血小板凝胶的制备方法，其特征在于它是按以下步骤进行：一、血液采集与高浓度PRP分离根据慢性皮肤损伤面积用枸橼酸钠采血管按如下公式进行外周全血采集；V≥2S～5S；其中，V为采血体积，单位为mL；S为伤口面积，单位为cm2；采集的外周血采用PRP的分离方法进行分离：A、将采集的外周全血在2～8℃条件运送到分离室，将外周全血混匀后，取部分进行血小板浓度计数3次，取平均值作为血小板浓度；B、将混匀后外周全血进行离心收集富含血小板血浆，离心条件为150～200g，15min，离心完毕取出此步下层富含血小板血浆和上层乏血小板血浆，记录体积并抽取部分进行血小板浓度计数3次，取平均值作为血小板浓度；C、将步骤B收取的血浆进行第二次离心，离心条件为900～1300g，20min，吸出上层乏血小板血浆，留取下层富血小板血浆，保证留取的下层富血小板血浆体积是步骤A外周全血体积的1/10，利用移液器吹打底部充分悬起贴于离心管底部的血小板沉淀，然后进行皮肤愈合相关因子浓度检测并进行计数血小板浓度；最终计算血小板的分离效率及浓缩倍数；血小板的分离效率＝步骤B离心收集血浆的血小板浓度×步骤B离心收集血浆的体积/(外周全血血小板浓度×外周全血的体积)×100％；血小板浓缩倍数＝富血小板血浆中血小板浓度/步骤B离心收集血浆的血小板浓度；二、皮肤采集与真皮间充质干细胞分离、培养及冻存1)取材：取皮肤组织用无菌镊子移入盛标本贮存液的样本采集瓶中并封口，在2～8℃条件下运回实验室进行分离操作；2)消毒、漂洗：D、复合抗生素的制备：用生理盐水将万古霉素、盐酸环丙沙星、头孢噻肟钠、庆大霉素和两性霉素分别配制成储存浓度，分装后于‑20℃保存；储存液浓度分别为：万古霉素0.05～0.2g/mL，盐酸环丙沙星15～25mg/mL，头孢噻肟钠0.15～0.25g/mL，庆大霉素3500～4500U/mL，两性霉素B 15～25mg/mL；E、含复合抗生素的洗涤液配制：取样本采集瓶，加入体积为50mL的医用生理盐水，然后向其中加入步骤D配制的抗生素，加入体积分别为：万古霉素2～7μL，环丙沙星20～30μL，头孢噻肟钠120～130μL，庆大霉素70～80μL，两性霉素B 20～30μL；F、用无菌镊子将步骤1)采集的样本组织从采集瓶中取出放入无菌器皿中，然后向无菌器皿中加入20mL含复合抗生素的洗涤液，消毒5～10min，将样本组织再用生理盐水漂洗3次以去除抗生素和血细胞；3)细胞分离：G、刮掉样品中皮肤的皮下组织及血管，再将皮肤剪至2～5mm边长的方形，将每个方形组织块的表皮切除，组织去除表皮及皮下组织，留下真皮层后移入无菌器皿内，将组织切割成大小为0.5～1.5mm2的块；H、组织酶解分离细胞：将大小为0.5～1.5mm2的真皮组织放入15mL离心管中，加入3mL复合胶原酶溶液中，在温度为37℃，转速为133rpm摇床孵育2h后取出在安全柜中吹打出细胞，然后用100μm细胞滤网过滤出组织块，进行取样计数及活率；4)细胞培养I、完全培养基配制：基础培养基为a‑MEM，加入EGF 110～130ng/mL，胰岛素130～170ng/mL，转铁蛋白10～20μg/mL，抗坏血酸10～20μg/mL及体积百分含量为5％UltraGRO血清替代物；J、细胞接种培养所得细胞悬液于1300rpm离心5min弃上清，利用完全培养基重悬至5×104/mL，接种至6孔细胞培养板中，每孔2mL，72h后进行换液处理；K、细胞传代及冻存细胞每3天进行换液处理，换液时应用生理盐水对细胞皿底进行吹打洗涤，去除杂质，待细胞密度达70％，进行传代处理，经500μL 0.3×TrypLE Express消化3min后，用500μL基础培养基稀释吹打出间充质细胞以去除内皮类细胞，细胞离心后用步骤I的完全培养基重悬至3.75×104/mL接种至T75培养瓶中，每瓶10mL，培养至P4‑P5代进行无血清冻存；三、含皮肤间充质干细胞生物分泌型富血小板凝胶制备利用新鲜或冻存的DMSCs细胞及新鲜分离的PRP进行分泌型富血小板凝胶制备，用浓缩倍数为1.5～2倍的富血小板血浆按1×106/mL细胞密度进行重悬混匀，将3M透气透明敷料加入到所需面积的平皿中，将含细胞的富血小板血浆重悬液平铺在3M透气透明敷料上，铺设厚度为2～5mm，利用注射器多点滴加的方式加入医用CaCl2溶液，每毫升含细胞的富血小板血浆重悬液需加入300～500μL/mL医用CaCl2溶液，在温度为37℃静置20min，即凝固为分泌型富血小板凝胶。