[发明专利]一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法

摘要

本发明公开一种肿瘤细胞中周细胞的分离和仿生培养方法，涉及肿瘤生物学领域。本发明方法突破了以往只用两种非特异性抗体标记周细胞的方法；首次用10个抗体标记(5个阳性标记，5个阴性标记)针对周细胞进行了分离、纯化和鉴定。并在显微镜下通过形态鉴定，可以明显看出周细胞在仿生基质培养基中可形成微管，这点符合周细胞的形态特征，并重现周细胞在体内的生长，为其进一步的功能研究奠定了基础。

主权项

1.一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法，其特征在于：所有分离操作均在超净台中进行，包括如下步骤：(1)取新鲜的肿瘤组织样本，用生理盐水冲洗至无血色为止，并除去凝固的血；(2)将组织剪碎；(3)将酶解液加入至剪碎后的组织中，然后打碎组织，酶解完后加DMEM全培终止反应；所述的酶解液为：包含DMEM培养基，1～2.5％胶原蛋白酶Type Ⅰ，1～2.5％胶原蛋白酶Type Ⅲ，1～2.5％胶原蛋白酶TypeⅣ和0.5～1.5％的DNA酶；设置温度37℃；酶解时间为0.5～2小时；(4)酶解完后离心，吸去上层脂肪组织，剩余液体加生理盐水重悬，静置，细胞滤网初滤；所述的细胞滤网的孔径为150～200μm；(5)离心，弃上清，加生理盐水重悬；用生理盐水润湿过的细胞筛网，过滤细胞；所述的细胞筛网的孔径为70～100μm；(6)过滤后的细胞再用细胞筛网过滤；除去滤液，将筛网上层未滤过的细胞移出；所述的细胞筛网的孔径为40μm；(7)离心，除去上清；加入PBS缓冲液重悬细胞，数细胞；(8)采用流式分选对周细胞和内皮细胞进行标记并鉴定；选择了10个抗体分别作为周细胞的阳性和阴性鉴定；3个抗体作为内皮细胞的鉴定抗体；每个反应体系5×105个细胞；避光加入抗体和DAPI染料后涡旋混匀，4℃避光反应30～60分钟；每隔15分钟轻弹管壁，以促使其完全反应；孵育后的样品加PBS缓冲液洗两次，离心；弃去上清加入PBS缓冲液进行流式分选；所述的10个抗体为阳性标记包括：CD13，CD140b，CD146，NG2，alpha SMA；阴性标记包括：CD31，CD34，CD11b，CD140a，CD45；所述的3个抗体为阳性标记包括：CD31，CD34；阴性标记包括：CD45；(9)以制备12mL培养涂层溶液为例，取90～120μL 30μg/mL胶原蛋白溶液和20～40μL纤连因子加入到11.84～11.89mL 0.1％明胶溶液中，轻微摇晃以铺平板；铺上涂层后的培养板置于37℃培养箱中培养30～60min后，放入4℃凝固16小时以上；在接种细胞之前立即吸出过量的溶液，用少量培养基简单冲洗以中和酸度；(10)流式分选后的周细胞，加入周细胞培养基PM，置入有涂层的培养板中，37℃培养；注：培养期间不要换液；(11)培养后通过观察，确定其为周细胞。