[发明专利]一种定向聚合的荧光探针PCR

摘要

一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征是常规引物、探针特异结合外增设各自定向聚合，采用对侧原引物5'端一段反向碱基序列，按5'‑3'方向加至引物对前面，形成“5'反向互补序列”嵌合引物对而定向聚合，借助5'端互补使扩增产物3'尾也互为模板、互为引物扩增，在PCR超敏基础上进一步提高灵敏度3‑5Ct和降低非特异性，或同样灵敏度情况可减少扩增5个循环；荧光探针3'加长尾端与探针中部序列反向互补两‑两自身杂交，从而借尾部‑中部两处相互聚合使淬灭基团靠近荧光基团降低基线荧光和探针非特异性，一旦长序列靶分子链特异杂交引物、探针链，相对竞争力弱的两两聚合引物对、探针解链而特异结合靶分子进行扩增、探针被聚合酶水解产生与靶分子成正比的荧光。

主权项

1.一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征是引物、探针特异序列基础上设置定向的引物对5’端互补结合、增敏和荧光探针3’尾定向聚合、解链PCR，引物设计采用对侧原引物5'端5‑10b反向碱基序列，按5'‑3'方向加至引物对前面，形成“5'反向互补序列”嵌合引物对而定向聚合，借助5'互补使扩增产物3'尾也互为模板、互为引物扩增，以＞2n几何级数放大而增加灵敏度和竞争降低引物3'聚合PD非特异性；常规水解荧光探针3'末端添加与探针中部反向互补的5‑8b尾序列，形成两探针分子间借尾部‑中部两处靠近的相互杂交而定向聚合，探针两端荧光素‑淬灭基团靠近而降低反应基线荧光，探针自身聚合抑制与引物间聚合非特异性；一旦长序列靶分子链竞争杂交引物、探针链，相对结合力弱的两两聚合引物对、探针解链而结合靶模板分子进行扩增、探针被聚合酶水解产生荧光。