[发明专利]一种白芍栽培种质鉴定的方法

摘要

本发明公开了一种白芍栽培种质鉴定的方法，研究以安徽道地产亳白芍为主样本，通过基于近缘物种基因组的进行多态性筛选，先用酶切的方法建库，然后上Illumina二代测序仪测序，对读到的序列进行微卫星分析，找出其中SSR重复单元比较多的序列，设计合成M13加尾引物在不同来源药用栽培白芍种质群体样本中进行多态性验证。本发明结构科学合理，使用安全方便，进一步样本验证表明，其中1对引物多态性高、重复性好，可以通过多态性片段长度测序的大小和峰形区分白芍种质来源，为白芍种质种苗的鉴定提供了有效可靠的鉴定依据，为解决品种来源问题提供了一种新的手段。

主权项

1.一种白芍栽培种质鉴定的方法，其特征在于：所述栽培种质鉴定方法如下：步骤一：选取亳白芍为主样本，杭白芍、川白芍作为验证样本；步骤二：仪器与试药选择，NAS‑99分光光度计、BC‑subMIDI电泳槽、BG‑Power300C电泳电源、1‑14离心机、Verity PCR仪、凝胶成像仪、DHP‑9052恒温培养箱、摇床、3730xl基因分析仪、HiSeq2500，内切酶HaeIII(NEB R0108M)、Hi‑Di去离子甲酰胺、POP‑7胶、10×Buffer(4311320)、Platinum taq酶(Thermo，10966026)；步骤三：采用改良CTAB法提取样品DNA，凝胶电泳检测质量，用HaeIII酶对主样本DNA进行酶切打断实验，将酶切产物进行5’末端修复，同时对5’末端进行磷酸化修饰，3’末端加A，使之与solexa接头5’端T互补，提高接头连接效率，阻止solexa接头自连，3’和5’端分别修饰完成之后，继续连接solexa测序接头，将连接产物锚定在flowcell上，进行桥式扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR扩增；步骤四：将步骤三所述的进行桥式扩增，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR扩增，增大文库量后上机检测，筛选测序结果，保留重复次数≥5次的序列，剔除载体序列，使用Primer Premier 5.0设计引物；步骤五：不同引物进行扩增，TP‑M13‑SSR扩增反应体系为10μL，降落扩增程序；步骤六：将步骤五所述的不同引物进行扩增，降落扩增程序后运用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，挑选有目的条带的产物上3730xl基因分析仪检测后进行数据分析；步骤七：通过不同来源的随机两份验证样本进行再次扩增后进行测序，筛选后获得6对具有多态性引物；步骤八：将步骤七所述的筛选后获得6对具有多态性引物TP‑M13‑SSR所检测的不同药用白芍栽培种质在不同SSR位点的多态性原始数据；步骤九：观察验证原始测序峰图，利用筛选的SSR引物对14份不同白芍种质材料进行扩增后测序，获得不同位点的等位基因片段大小。