[发明专利]牛活体或离体采集卵母细胞体外受精胚胎培养的方法

摘要

本发明涉及牛活体或离体采集卵母细胞体外受精胚胎培养的方法。该方法包括如下步骤：卵母细胞的采集和体外成熟，其中的卵母细胞采集可以采用离体采集或者活体采集；体外受精，成熟的COCs在受精培养液中培养箱后与精子悬液共孵育培养；胚胎体外培养及液氮中冷冻保存。本发明方法呈现如说明书所述优异技术效果。

主权项

1.一种牛体外受精胚胎培养的方法，其包括如下步骤：(1)卵母细胞的采集和体外成熟离体采集：取屠宰场卵巢盛放于加双抗生理盐水的保温桶中，31‑33℃条件下，3h内运回实验室；抽取表面2‑8mm的卵泡，收集沉淀，在体视显微镜下捡出至少含有3层卵丘细胞包裹的卵母细胞COCs(即，卵丘‑卵母细胞复合体)，在洗卵液中洗涤2遍，去除多余杂质；活体采集：对牛进行活体采卵，将所得卵泡液在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘‑卵母细胞复合体(COCs)，放入包含HEPES的成熟培养液中38.8℃、3h内运回实验室；将以上离体采集或者活体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22‑24h，培养条件为38.8℃、5.5‑6.5％CO2、饱和湿度；(2)体外受精将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300μL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16‑20h，培养条件为38.8℃、5.5‑6.5％CO2、饱和湿度；(3)胚胎体外培养及保存体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6％O2、88％N2、饱和湿度，第3天记录卵裂率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率(其为孵化囊胚数除以囊胚数所得百分数)，并进行质量鉴定；将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至‑35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存。