[发明专利]酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及其应用

摘要

本发明阐述了一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及其应用，属于生物技术领域。方法为克隆高活性的酪氨酸酚裂解酶基因，和信号肽基因共表达，转化大肠杆菌感受态细胞，构建信号肽介导的酪氨酸酚裂解酶胞外分泌工程菌，实现胞外表达，所得酪氨酸酚裂解酶发酵液用于转化合成酪氨酸及衍生物。本发明采用胞外表达方式构建酪氨酸酚解酶工程菌株，酶释放放量达到50％以上，减少蛋白在胞内过度堆积对细胞产生的毒性，总酶活较普通表达提高36％。发酵产生的酶部分释放到发酵液中，菌体细胞通透性良好，有利于底物同酶的接触，大幅度提高酶的催化效率。可以直接采用发酵液催化底物生产L‑酪氨酸及衍生物，无需破碎细胞提取纯酶进行反应，节约酶的使用成本。

主权项

1.一种酪氨酸酚裂解酶的胞外表达工程菌的构建方法，其特征在于它的具体步骤如下：1)TPL工程菌构建根据Erwinia herbicola中TPL的基因序列和克隆载体pET28a的序列信息设计含有接头和限制性内切酶位点的上下游引物，以Erwinia herbicola ATCC21434基因组DNA为模板，克隆Erwinia herbicola酪氨酸酚裂解酶编码基因TPLSEQ.NO.1，然后利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒把PCR片段与经过NdeI和Xho I酶切载体pET28a进行连接，得到酪氨酸酚裂解酶表达质粒pET28a‑TPL；2)TPL和torA共表达工程菌构建合成trimethylamine‑N‑oxide reductase的信号肽torA编码基因SEQ.NO.2，利用NdeI和NcoI分别将torA编码基因和质粒pET28a‑TPL双酶切，然后二者进行连接构建得到带有torA信号肽的酪氨酸酚裂解酶表达质粒pET28a‑torA‑TPL，检测正确后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到酪氨酸酚裂解酶胞外表达工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a‑torA‑TPL。