[发明专利]一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法

摘要

本发明是一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法，属于基因工程技术领域，包括如下步骤：首先将待检测样品固定，脱水，包埋制备成组织切片，并配制液相PCR反应体系、通过PCR反应程序，对组织切片中原位固定的靶DNA进行扩增，再将特异性探针与扩增后的组织切片进行原位杂交，最后通过免疫酶标技术在显微镜下对检测结果进行判断，如果出现蓝紫色阳性信号，则表示该样品的牡蛎疱疹病毒检测结果为阳性并可对病毒做到精确定位。其优点是：本发明结合普通液相PCR方法灵敏度高和原位杂交方法可以实现组织定位的优点，从而达到对牡蛎疱疹病毒的灵敏、特异检测和精确定位。该检测方法可用于贝类各时期养殖过程中的牡蛎疱疹病毒的跟踪检测，具有很高的使用价值。

主权项

1.一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1）探针制备：以牡蛎疱疹病毒阳性样本DNA为模板，采用C2/C6引物，经PCR 扩增制备探针；引物信息如下：C2：5＇‑ CTCTTTACCATGAAGATACCCACC ‑3＇、C6：5＇‑ GTGCACGGCTTACCATTTTT ‑3＇；所用PCR反应体系为：10×PCR Buffer 10.0µL，MgCl2 6.0µL，10×PCR DIG Labeling Mix 10.0µL，C2 4.0 µL，C64.0 µL，DNA聚合酶1.0µL，DNA模板4.0µL，去离子水61µL，总体系100µL；所用PCR反应程序为：94℃预变性2 min，95℃变性45s，55℃退火45s，68℃延伸2min，30个循环，4℃保存；2）消化：使用一定浓度的蛋白酶K对组织石蜡切片进行特定时间的消化；3）间接原位扩增：以预混好的PCR反应体系对组织切片靶DNA进行原位扩增；所用间接原位扩增PCR反应体系为：10×PCR buffer 5.0µL，MgCl24.0µL，dNTP5.0µL，DNA聚合酶1.0µL，C2/C6引物各2.0µL，去离子水31µL，总体积50µL；所用PCR扩增程序为：94℃预变性2min，95℃变性1min，55℃退火1min，68℃延伸2min，20个循环；4）预杂交与杂交：取间接原位扩增后的组织切片进行预杂交与杂交；将扩增后的组织切片加入500µL预杂交液42℃在湿盒内预杂交2h；所述预杂交液包括50%去离子甲酰胺，4×SSC，10%硫酸葡聚糖，10×Denhardt’s，250µg/ml转移核糖核酸；吸取预杂交液加入500µL含有探针的杂交液，所述杂交液其中的探针浓度为2.5 ng/µL；加盖硅化盖玻片，置于原位杂交炉中，95℃、5 min将靶DNA与探针变性，然后迅速至于冰上5 min后42℃湿盒内杂交过夜；5）洗涤与抗体孵育：将杂交后的组织切片移去盖玻片，2×SSC 室温 10min，1×SSC 37℃ 10min，0.5×SSC 42℃10 min，0.1×SSC 42℃ 10min；马来酸平衡5 min后，使用封闭剂室温下封闭2h，每片组织切片上滴加500µL用封闭剂按1:1000稀释的碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体孵育4℃过夜；6）显色与观察：通过免疫酶标技术对组织切片显色，复染，显微镜观察，则确定所检测样本是否被牡蛎疱疹病毒所感染以及感染的具体组织细胞位置；含Tween‑20的磷酸盐缓冲液充分洗涤，吸取配制好的碱性磷酸酶底物显色剂200 μL滴加在组织切片上，湿盒内室温显色30min，核固红复染2min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；光镜下阳性部位呈现蓝紫色或深紫色杂交信号。