[发明专利]一种基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法

摘要

本发明属于PCSK9抑制剂技术领域，具体涉及一种基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法，包括以下步骤：合适密度肝类细胞的铺板传代，加入待测药物及重组rhPCSK9，之后利用RIPA裂解细胞，取细胞裂解液进行Western blot，检测LDLR含量的变化，同步利用β‑actin蛋白作为内标标定蛋白总量，LDLR的条带灰度值与β‑actin蛋白的条带灰度值比值越大，证明药物对PCSK9的抑制效果越强。本发明方法通过往细胞中添加重组PCSK9蛋白，找到最佳的添加浓度和作用时间，扩大PCSK9与LDLR的作用窗口，更容易进行PCSK9抑制剂的筛。

主权项

1.一种基于细胞的PCSK9抑制剂筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，细胞的处理S11，传代细胞，收集待测细胞样品；所述细胞为肝类细胞；S12，加药处理利用DMSO或者PBS溶解所述待测细胞样品，加入待测药物和重组rhPCSK9；培养细胞20‑24h，得到加药处理细胞液；其中所述重组rhPCSK9是根据人pcsk9基因的cDNA序列合成pcsk9基因，然后将pcsk9基因整合入真核表达载体pCMV‑C‑His，得到的真核表达载体pCMV‑pcsk9‑His；其中所述待测药物为待筛选的PCSK9抑制剂；S2，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞，并收集裂解后的上清液；S3，Western‑Blot检测S2中所得上清液进行上样前处理，处理后上清溶液进行Western‑Blot，检测LDLR抗体含量，同时利用β‑actin蛋白作为内标标定蛋白总量，比较LDLR抗体和β‑actin蛋白的检测结果，LDLR抗体的条带灰度值与β‑actin蛋白的条带灰度值比值越大，证明该待测药物对PCSK9的抑制效果越强。