[发明专利]一种显著缩短诱导时间的细叶百合体细胞胚直接发生方法

摘要

本发明涉及一种显著缩短诱导时间的细叶百合体细胞胚直接发生方法，包括如下步骤：细叶百合无菌苗接种于附加60g·L‑1蔗糖的MS培养基中，培养45天后取外层鳞片接种于体细胞胚诱导培养基中，黑暗培养30天获得球形胚；将包含球形胚的培养物转接于体细胞胚增殖培养基中，培养20天获得次生原胚，并以次生体胚的形式进行增殖；将次生原胚转接至MS培养基中，光照培养20天即可萌发成苗。本发明首次通过直接再生途径获得细叶百合体细胞胚，有效解决了体胚诱导周期长的问题，获得球形胚以及最终获得组培苗的时间缩短90天，外植体来源稳定、步骤简单易行，重复性高，可为细叶百合快速繁殖、种质保存和遗传转化提供高效稳定的再生体系。

主权项

1. 一种显著缩短诱导时间的细叶百合体细胞胚直接发生方法，其特征是：包括以下步骤：步骤1）外植体培养阶段细叶百合无菌苗接种于添加60 g·L‑1蔗糖和7 g·L‑1琼脂的MS培养基中，培养室温度为25±1℃，保证组培瓶内湿度达85%，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m‑2·s‑1；接种45天后，取无菌苗的外层鳞片进行体细胞胚诱导；步骤2）原胚诱导阶段取步骤1培养获得的鳞茎直径达1 cm的细叶百合外层鳞片，在超净工作台上，切去四周，成0.5×0.5 cm的小块，凹面向上，接种于MS + 4.0 μmol·L‑1 PIC（毒莠定） + 0.01 μmol·L‑1 ABA（脱落酸）的体细胞胚直接诱导培养基中，附加蔗糖30 g·L‑1，琼脂7 g·L‑1，pH 5.8；黑暗培养，培养室温度为25±1℃，保证组培瓶内湿度达85%；接种25天，在鳞片外植体表面形成颗粒性明显的原胚，30天可见球形胚；步骤3）体细胞胚增殖阶段将步骤2培养获得的长出球形胚的培养物（胚性培养物），转移至体细胞胚增殖培养基MS + 4.0 μmol·L‑1 PIC+1.0 μmol·L‑1 NAA（萘乙酸），继续黑暗培养，培养室温度为25±1℃，保证组培瓶内湿度达85%，接种20天后，在初生体胚周围，可形成2~4个次生原胚；在体细胞胚增殖阶段，需调整培养基中激素的浓度以使培养物保持胚性状态，具体方法为：增殖培养30天后，将培养物转接至新的增殖培养基MS + 1.0 μmol·L‑1 PIC中，而后交替使用上述两种培养基（MS + 4.0 μmol·L‑1 PIC+1.0 μmol·L‑1 NAA和MS + 1.0 μmol·L‑1 PIC），每30天更换一次，以达到降低畸形胚的比率的目的；步骤4）体细胞胚萌发和成苗阶段将步骤3培养获得的次生原胚转移至MS培养基中培养，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m‑2·s‑1，培养室温度为25±1℃，采用半透膜封口，保证组培瓶内湿度达70%，次生原胚依次经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶形胚阶段，20天后萌发成苗。