[发明专利]一种肿瘤样品测序参考品的制备方法

摘要

本发明提供了一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，属于高通量测序技术领域，所述方法包括以下步骤：对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系并提取全基因组；测定等位基因频率测定；根据等位基因突变频率与目标等位基因突变频率确定稀释倍数；用阴性细胞倍比稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞；提取混合细胞的全基因组，测定等位基因突变频率；根据混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，细化倍比稀释的倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。本发明所述方法采用对细胞株单克隆结合高通量测序确定细胞系的基因背景；使用多步骤逐步细化的倍比稀释法结合流式细胞仪对细胞精确计数，保证参考品制备的高度可重复性。

主权项

1.一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，包括以下步骤：1)对肿瘤细胞系进行单克隆培养，获得单克隆细胞系；2)提取所述单克隆细胞系的全基因组；3)利用高通量测序对所述单克隆细胞系的全基因组进行等位基因频率测定，获得等位基因突变频率；4)根据步骤3)中获得的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率，确定对单克隆细胞系的稀释倍数；5)胰酶消化所述单克隆细胞系后，用流式细胞仪计数获得单克隆细胞系的细胞浓度，以细胞数计，用相应数量的等位基因突变频率为0的阴性细胞按照步骤4)中确定的倍数稀释所述单克隆细胞系，获得混合细胞；6)提取步骤5)中所述混合细胞的全基因组，利用高通量测序对所述混合细胞的全基因组进行等位基因测定，获得混合细胞的等位基因突变频率；7)将步骤6)中获得的混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，如混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，则按照步骤4)中的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品；若混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率不一致，则细化稀释的倍数；重复步骤5)和6)，直到混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率一致，按照此时的稀释倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。