[发明专利]一种构建桔小实蝇白眼品系的方法

摘要

本发明公开了一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，将Cas9 mRNA与靶基因gRNA混合后，利用显微注射的方式，注射到胚胎中，再经过遗传杂交获得桔小实蝇白眼品系。本发明考虑了最佳的研究步骤和技术参数，构建了桔小实蝇白眼品系的基因编辑方法，快速、准确地获得稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系，填补了技术空白，为桔小实蝇的生物学研究提供了理想的实验材料及研究思路，具有良好的应用前景。

主权项

1.一种构建桔小实蝇白眼品系的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以线性化Cas9质粒为模版，进行体外转录，合成Cas9 mRNA；2)选择white基因靶点，确认选择的靶点位于一个单独的外显子，设计含有white基因靶点的上游引物及与其匹配的下游引物，进行PCR扩增，将PCR产物与载体连接并转化到感受态细胞，Amp抗性平板涂布，进行菌落PCR确定阳性克隆，培养阳性菌株后提取质粒，以所提取质粒为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物，体外转录合成gRNA；其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；3)对桔小实蝇胚胎显微注射gRNA和Cas9 mRNA的混合溶液，然后继续培养，直至成虫羽化；混合溶液中Cas9 mRNA的浓度为300～400ng/μ L ，gRNA的浓度为50～60ng/μ L ；4)遗传杂交获得桔小实蝇白眼品系：羽化成功的G0代雌性成虫与G0代雄虫杂交，获得了G1代白眼雄虫；将G1代白眼雄虫与野生型雌虫杂交，获得G2代雌虫，将G2代雌虫与G1代白眼雄虫回交，获得G3代白眼雄虫和G3代白眼雌虫，然后将G3代白眼雄虫和G3代白眼雌虫混合培养，即可获得可以稳定遗传的纯合桔小实蝇白眼品系。