[发明专利]基于dnaJ基因的弧菌种属鉴定引物及其使用方法

摘要

本发明提供了基于dnaJ基因的弧菌种属鉴定引物及其使用方法，目的是为了能有效控制弧菌病的发生与流行、保障海水养殖业的健康发展。针对弧菌共有的dnaJ基因，在dnaJ基因序列两端的保守区域设计一对可扩增几乎全长dnaJ基因的简并引物，而建立的扩增弧菌几乎全长dnaJ基因的PCR方法。该方法具有快速、便捷、灵敏、准确、适应性好等优点，不仅可用于弧菌属细菌的快速检测，结合序列测定分析还可以准确鉴定弧菌的种类，为有效地控制弧菌病的发生与流行奠定了基础。

主权项

1.一种基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法，其特征在于，特异性引物的设计，具体为在dnaJ基因序列两端的保守区域设计一对可扩增几乎全长dnaJ基因的简并引物，上游序列为XX‑VF1：5′‑GTGATTTTTACGAAGTATTAGGC‑3′，下游序列为XX‑VR1：5′‑GGTTAAATCRTCRAARAACTT‑3′，具体包括如下步骤：S1：标准菌液制备，取纯的弧菌属以及纯的非弧菌属菌株划线于含3％氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，条件为36±1℃培养18～24h，取上述菌液1～3mL，以10 000r/min离心1min，弃上清，收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒按说明书操作提取DNA；S2：样品处理，取含有弧菌的样品先接种到3％氯化钠碱性蛋白胨水培养基进行增菌培养，条件为36±1℃培养8～18h，再取增菌液于硫代硫酸盐‑柠檬酸盐‑胆盐‑蔗糖培养基，条件为36±1℃培养18～24h，然后选取生长优势的菌落接种于含3％氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，条件为36±1℃培养18h～24h，最后挑选纯培养的单个菌落，接种于含3％氯化钠的胰蛋白胨大豆肉汤培养基，条件为36±1℃培养18～24h，取上述菌液1～3mL，以10 000r/min离心1min，弃上清，收集菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒按说明书操作提取DNA；S3：PCR扩增，取步骤S2中的待测液体，依次加入25μl2×F8 FastLong PCR MasterMix、2μl浓度均为20μmol/1的上下游引物、5.0μl步骤S1中的菌液模板，并用灭菌水补足至50μl，混合均匀，置于PCR仪上进行DNA扩增，94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15min，进行35个循环；最后72℃延伸5min，4℃结束保存；S4：结果，扩增后的产物经电泳，在紫外线下照射，能检测到弧菌属的细菌均可扩增出分子量为1130bp的目的条带，非弧菌属的细菌均没有扩增到条带。