[发明专利]一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用

摘要

本发明提供了一种利用光合细菌合成3‑羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用，本发明旨在通过构建3‑羟基丙酸新的合成途径，通过在光合细菌R.pal中表达外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因，建立一条新的生物合成3‑羟基丙酸的方法，从而获得含有本体丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB、外源丙二酸单酰辅酶A还原酶C段及丙二酸单酰辅酶A还原酶N段对应的编码基因的重组细胞，同时由本体表达的NAD(P)转氢酶PntAB和外源NAD(+)激酶YfjB的表达辅以还原力NADPH的供应。该重组细胞能够以丙二酸盐为底物合成3‑羟基丙酸，从而建立一条新的更为简短高效的生物催化生产3‑羟基丙酸的方法。

主权项

1.一种利用光合细菌合成3‑羟基丙酸的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1) 分别克隆mcrC基因、mcrN基因、YfjB基因、matA基因、lldA基因；(2) 构建载体pJQ200SK‑mcrC/matA分别扩增matA 基因编码序列上下游的同源臂matA‑up和matA‑down，扩增mcrC 基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的matA‑up、mcrC和matA‑down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK‑mcrC/matA；(3) 构建载体pJQ200SK‑mcrN/lldA分别扩增lldA 基因编码序列上下游的同源臂lldA‑up和lldA‑down，扩增mcrN 基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的lldA‑up、mcrN和lldA‑down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK‑mcrN/lldA；(4) 构建载体pJQ200SK‑yfjB/RPA3450分别扩增RPA3450基因编码序列上下游的同源臂RPA3450‑up和RPA3450‑down，扩增yfjB基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的RPA3450‑up、yfjB和RPA3450‑down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK‑yfjB/RPA3450；(5) 将包含pJQ200SK‑mcrC/matA质粒的大肠杆菌与R. pal CGA009进行接合，筛选获得工程菌株R. pal CGA009‑mcrC/matA；(6) 将包含pJQ200SK‑mcrN/lldA质粒的大肠杆菌与所述R. pal CGA009‑mcrC/matA进行接合，筛选获得工程菌株R. pal CGA009‑mcrC/matA‑mcrN/lldA；(7) 将包含pJQ200SK‑yfjB/RPA3450质粒的大肠杆菌与所述R. pal CGA009‑mcrC/matA‑mcrN/lldA进行接合，筛选获得工程菌株R. pal CGA009‑mcrC/matA‑mcrN/lldA‑yfjB/RPA3450；(8) 将活化后的R. pal CGA009‑mcrC/matA‑mcrN/lldA‑yfjB/RPA3450接种到含有丙二酸盐的培养液中培养，光照培养，最终发酵获得3‑羟基丙酸。