[发明专利]一种RNA干扰钙敏感受体CaSR的Caco-2稳定细胞株的建立方法

摘要

本发明公开了一种RNA干扰钙敏感受体CaSR的Caco‑2稳定细胞株的建立方法，其包括以下步骤：a、siRNA‑CaSR重组干扰质粒的构建：b、统计学处理；c、构建质粒的鉴定。通过上述步骤设计，本发明通过构建稳定表达siCaSR的Caco‑2细胞株，观察所构建的siRNA表达载体对CaSR mRNA和蛋白的表达影响，为后续研究CaSR在RV感染及其诱导的腹泻中的作用提供一个有用的实验工具。

主权项

1.一种RNA干扰钙敏感受体CaSR的Caco‑2稳定细胞株的建立方法，其特征在于，包括有以下步骤，具体的：a、siRNA‑CaSR重组干扰质粒的构建：a1、通过检索NCBI数据库并设计RNA干扰序列，选取5’‑AAGGAGATCGAGTTTCTGT‑3’作为实验组的干扰序列，合成相应的DNA序列；对于合成的DNA序列，其正义链为： 5’‑TC‑CCAAGGAGATCGAGTTTCTGTTCAAGAGACAGAAACTCGATCTC‑CTTTT‑3’，反义链为：5’‑CAAAAAAAGGAGATCGAGTTTCT‑GTCTCTTGAACAGAAACTCGATCTCCTT‑3 ’， 正义链中的TC‑CCAAGGAGATCGAGTTTCTGT、ACAGAAACTCGATCTC‑CTTTT为靶向CaSR 干扰序列，反义链中的CAAAAAAAGGAGATCGAGTTTCT‑GT、ACAGAAACTCGATCTCCTT为靶向CaSR 干扰序列；干扰序列经Blast分析，序列与人的其他编码序列无同源性；选取5’‑GAGTTAACGTGAGGTACTT‑3’作为阴性对照干扰序列；寡核苷酸链经过退火形成双链，连接至经过BbsⅠ内酶酶切过的siRNA载体，该BbsⅠ内酶购自TIANGEN生物公司；阳性干扰质粒命名为siRNA‑CaSR，阴性对照干扰质粒命名为siRNA‑scrambled，空白对照质粒命名为siRNA‑empty；a2、 siRNA‑CaSR重组干扰质粒的提取：将重组质粒转化至E.coliDH5α菌株中，37 ℃恒温箱中培养12 h，在含氨苄青霉素的固体培养基中挑选阳性克隆，用含1∶1000氨苄抗生素的100 mL LB 液体培养基，200 rpm，37 ℃培养12‑16 h；利用购自TIANGEN生物公司的质粒提取试剂盒并按照TIANGEN生物公司的质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取；提取的质粒通过NanoDrop核酸蛋白滴定仪测定浓度及纯度，并将所提取的质粒进行测序；a3、细胞培养：Caco‑2细胞复苏后加入 10% 灭活新生胎牛血清的DMEM培养液，于二氧化碳培养箱中进行培养；待细胞贴壁生长到 80% 时用0.25% 胰蛋白酶液进行消化、传代，并取对数生长期细胞进行质粒转染实验；a4、质粒转染 ：将Caco‑2细胞接种于12孔板，分为实验组、阴性对照组以及空白对照组，每个孔铺2×105个细胞，利用购自于 PolyPlus 公司的脂质体转染试剂JetPei 并按照JetPei试剂说明书进行转染，放入37℃、5% CO2恒温培养箱进行细胞培养；转染24h‑48h后用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞株；细胞转染 72‑96h 后在荧光显微镜下观察其荧光表达情况；a5、嘌呤霉素浓度测定：将经转染的Caco‑2 细胞接种于 12 孔板，每个孔铺2×105个细胞，于二氧化碳培养箱中培养24h，实验组每孔分别加入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 μg/ml嘌呤霉素进行最小致死浓度的筛选，确定最小致死浓度为并按此浓度进行后续细胞筛选培养；a6、实时定量PCR检测CaSR mRNA 表达：Caco‑2细胞转染并培养48h，TRIZOL法提取细胞总RNA；经RNA浓度测定后，按Superscript First‑strand Synthesis System for RT‑PCR试剂盒配制RT反应液进行cDNA逆转录反应；用 SYBR 2×mix 进行PCR扩增，CaSR‑F: 5’‑GGGCTCTTTCCTATTCAT’‑3，CaSR‑R:5’‑GCTGTTTATCTCCTCTATG‑’3；内参GAPDH‑F:5’CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC‑3’，GAPDH‑R: 5’‑CCCAATACGACCAAATCCGTT‑3’；扩增条件为： 95°C 10min；94°C 25s，60°C 45s，72°C 30s，45 个循环；实验独立重复 3 次；a7、Western Blot检测CaSR蛋白的表达水平：将转染后培养 48h 的实验组和对照组细胞取出，加入含1%蛋白酶抑制剂的裂解液进行总蛋白的提取；采用BCA法检测样品蛋白的浓度；取适量样品加入5 ×上样缓冲液95℃变性后进行SDS‑PAGE 电泳，分离胶浓度 8% ，浓缩胶浓度 5%，将蛋白电转至PVDF上，室温封闭2h；加入稀释1：1000的一抗，4℃过夜孵育，洗膜三次后加入稀释1:10000的远红外标记的荧光二抗,室温避光孵育2h；用Western blot 远红外显影仪显影，记录结果；每次实验重复三遍；b、统计学处理：所有实验重复三次，定量数据以均数±标准差（）表示；各组CaSR的mRNA的表达量使用^‑△△Ct 方法计算；各组CaSR的蛋白表达以GAPDH表达水平进行相对定量；所有实验数据用 SPSS 16 统计软件处理；P＜0. 05 表明差异有统计学意义；c、构建质粒的鉴定：c1、质粒测序鉴定：初步鉴定正确的重组菌株，培养提取纯化质粒并进行序列检测，将所得的序列结果与设计序列进行比对分析得知测序结果与所设计的相符，提示本实验所用的序列大小及插入方向正确；c2、转染细胞的荧光表达水平：siRNA‑CaSR、siRNA‑scrambled、siRNA‑empty转染细胞48h 后，在荧光显微镜下观察细胞形态及荧光表达情况；c3、siRNA 对CaSR mRNA表达水平的影响：实时定量 PCR 检测目的基因 CaSR 的mRNA表达水平；c4、siRNA对CaSR 蛋白表达水平的影响：分别提取转染了 siRNA‑CaSR、siRNA‑Scramble及siRNA‑empty的Caco‑2 细胞总蛋白，Western Blot 检测CaSR蛋白的表达水平，结果显示：与siRNA‑scrambled及siRNA‑CaSR转染组相比，重组干扰质粒 siRNA‑CaSR 转染组中CaSR蛋白表达水平明显降低。